动物造模 中国实验动物信息网 2022-11-28 556

　　目的：建立成年狨猴肾脏细胞体外培养的培养体系,并将Cas9编辑系统初步应用于所培养的狨猴肾脏细胞,建立检测sgRNA切割活性的体系｡

　　方法：取成年的狨猴肾脏,采用贴壁法､消化法得到狨猴肾脏细胞｡对细胞进行生长曲线测定､转染试剂(Viafect和Lipo2000)及抗性(嘌呤霉素和杀稻瘟菌素)浓度筛选,将SIRT1的sgRNA质粒和Cas9质粒共转染狨猴细胞,提取基因组并对基因修饰目的片段扩增,并将扩增产物进行测序｡

　　结果:建立狨猴肾脏细胞体外培养体系;ViaFect转染试剂转染率大于60%;细胞抗性筛选适宜浓度嘌呤霉素4μg/mL,杀 稻瘟菌素8μg/mL;测序结果表明,从sgRNA的PAM序列附近开始出现突变峰,证明sgRNA成功引入突变｡

　　结论： 成功建立了狨猴肾脏细胞的体外培养､细胞转染和抗性筛选体系;CRISPR/Cas9可以用于狨猴肾脏细胞编辑,为 基因修饰狨猴靶点选择提供依据｡