动物造模 中国实验动物信息网 2022-09-02 672

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　健康清洁级雌Sprague-Dawley (SD)大鼠10只，4 周龄，由中南大学实验动物中心提供，进入实验室的体质量为70~90 g。全身健康要求：毛发色泽光亮，无脱毛，四肢和尾部无疾病，颈部无歪斜。所有大鼠于实验开始前1周饲养于同一动物房以适应环境，均能自由饮水和进食，食物为标准颗粒状饲料。动物房温度控制于20~22 ℃，通风良好，保持自然明-暗生物节律。

　　1.1.2 饲料和主要设备与化学试剂

　　大鼠标准的颗粒状饲料由中南大学实验动物学部提供；高脂饲料为自制(配方取自章涛等：普通饲料50%，猪油12%，奶粉10%，豆粉5%，花生2.5%，蔗糖5%，菜油1%，食盐1%)；旷场实验箱和配套Supermaze软件为上海欣软信息科技有限公司产品；Leica冰冻切片机为武汉中纪科学仪器有限公司产品；尼康显微镜为尼康仪器有限公司产品；多聚甲醛为天津市科密欧化学试剂有限公司产品；磷酸二氧钠为国际集团化学试剂有限公司产品；磷酸氢二钠为长沙安泰精细化工实业有限公司产品；蔗糖为广东光华科技股份有限公司产品；0.01 mol/L磷酸能缓冲溶液和DAB显色剂为北京中山金桥生物技术有限公司产品；c-Fos一抗为美国Santa Cruz公司产品，山羊血清、二抗以及三抗为美国Vector Labs产品；无水乙醇和二甲苯为国药集团化学试剂有限公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 高脂饮食模型建立

　　将10只雌性大鼠随机分成两组，每组5只。对照组用普通饲料喂养15周，高脂组用自制高脂饲料喂养15周。所有大鼠在造模期间自由摄食和饮水，饲料和水每2日更换1次。

　　1.2.2 行为学检测

　　1.2.2.1 旷场实验

　　旷场实验箱(长×宽×高：100 cm×100 cm×50 cm)，箱底标记成25个相等方格(20 cm×20 cm)，沿四壁的16个方格称为外围格，其余9个方格为中央格。进行实验时将大鼠放于正中央格，摄像并记录5 min大鼠穿行中央格格数、穿行的总格数以及中央格停留时间。在中央格停留时间占总时间(5 min)百分比与大鼠的焦虑样情绪呈负相关。穿越总格数反映动物的运动功能。

　　1.2.2.2 非竞争性掠食行为观察

　　掠食模型参照Li等的方法：动物掠食行为的观察在一单独、安静、隔音的房间内进行，房间内放有旷场(长×宽×高：150 cm×150 cm×50 cm)，旷场底及四壁为黑色，待测大鼠进行掠食行为观察前，需节食1周，每天给予少量食物，足量饮水，使体质量降到之前的80%左右；然后在观察前1 d禁食(不禁水)12 h，观察当日下午4:00将大鼠放入旷场中，适应2 h后，于旷场一侧放入一塑料制鼠笼(长×宽×高：30 cm×18 cm×16 cm)，将250 g标准的大鼠颗粒状饲料放于鼠笼的铁丝网顶盖上，2 h后，分别收集鼠笼顶盖上剩余饲料以及散落在旷场中的饲料，并分别称重。散落在旷场中的饲料量即为大鼠掠食量。

　　1.2.2.3 竞争性掠食行为观察

　　观察设备同非竞争掠食行为观察，观察前禁食(不禁水)12 h，观察当日下午4:00将大鼠放入旷场中，适应2 h后，于旷场一侧放入一塑料制鼠笼(长×宽×高：30 cm×18 cm × 16 cm)，鼠笼中放置一只同待测大鼠性别相同，来源于不同窝，之前从未接触的大鼠。将250 g标准的大鼠颗粒状饲料放于鼠笼的铁丝网顶盖上，2 h后，分别收集散落在旷场中的饲料以及鼠笼顶盖上剩余饲料，并分别称重。散落在旷场中的饲料量即为大鼠掠食量。

　　1.2.3 大鼠前扣带皮质 c-Fos 蛋白免疫组织化学检测在大鼠非竞争性掠食进行1 h 45 min时，迅速取出大鼠，用10%水合氧醛(40 mg/kg)于大鼠腹腔注射麻醉后迅速取脑，将脑组织置入固定液中后固定过夜，再分别置于15%，30%蔗糖PBS液中浸糖至沉底，用*佳切割温度(optimal cuttingtemperature，OCT)复合物包埋，置于恒温冰冻切片机连续切片，片厚30 m，取含前扣带皮质的切片。采用免疫组织化学ABC法对切片行c-Fos免疫组织化学染色、Olympus显微镜观察。对照组与高脂组各选取3张切片，拍照并计数10×10倍镜视野下阳性细胞。

　　1.3 统计学处理

　　数据以均数±标准差(x±s)表示，采用GraphPadPrism 5.0软件进行统计分析，两组间比较采用成组t检验，以P<0.05认为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 行为学检测

　　2.1.1 旷场实验

　　旷 场 实 验 结 果 如 图 1 所 示 ： 中 央 格 停 留时间百分比，高脂组(10.43%±2.87%)与对照组(12.23%±2.79%)相比，差异无统计学意义( t = 0 . 4 5 0 ， P = 0 . 6 6 4 7 ) ；穿行总格数，高脂组( 1 2 7 . 1 0 % ± 3 7 . 8 9 % ) 与对照组 ( 9 8 . 9 0 % ± 1 7 . 1 5 % ) 相比，差异无统计学意义(t=0.676，P=0.5172)。

　　2.1.2 掠食行为

　　掠食行为结果如图2所示：对照组大鼠在非竞争性掠食行为、竞争性掠食行为观察中，每2 h掠食量分别为(84.80±2.77) g，(89.94±1.96) g。高脂组在非竞争性掠食行为、竞争性掠食行为观察中，每2 h掠食量分别为(13.85±1.08) g，(12.25±1.07) g；与相应对照组相比掠食量减少(非竞争性掠食行为t=21.65，P<0.001；竞争性掠食行为t=32.17，P<0.001)。

　　2.2 大鼠前扣带皮质 c-Fos 蛋白免疫组织化学检测如 图 3 所 示 ： 对 照 组 阳 性 细 胞 数 为( 8 8 . 1 7 ± 4 . 1 4 ) 个 / 视野，高脂组阳性细胞数为(45.00±2.56)个/视野，对照组阳性细胞数目高于高脂组(t=8.868，P<0.001)。

　　3 讨 论

　　掠食行为是一种高度综合的模型，可用于探讨心理学、生理学、神经生物学等多学科的不同问题；同时，掠食行为也是行为科学理论研究的重要模型，掠食行为与决策、努力付出、成本/效益估计等认知功能密切相关。利用掠食行为阐明长期高脂饮食对认知功能的影响，探究长期高脂饮食对大鼠掠食行为的影响及机制，对人们的健康具有指导意义。

　　许多研究者利用啮齿类动物掠食行为探讨认知功能的神经生物学机制之前，往往要对动物进行人为训练，过多的训练影响大鼠的行为自主性，从而影响到掠食行为结果，不能反映其真实的神经生物学本质。因此，笔者采用了Li等的实验室大鼠掠食行为观察模型排除了人为因素对大鼠掠食行为的影响，并且定量测定大鼠的掠食行为，探讨其神经生物学机制。

　　旷场实验是评价啮齿类实验动物运动功能和状态焦虑的经典方法。我们以此来判定不是由运动能力、探究行为、动物情绪等改变造成动物掠食行为障碍。对照组与高脂组矿场实验结果表明，两组差异无统计学意义，提示高脂饮食对大鼠运动功能无影响。

　　本研究发现高脂组大鼠在非竞争性掠食行为、竞争性掠食行为中掠食量较对照组明显减少，这提示高脂组大鼠不愿付出努力去获取更多的食物，表明高脂饮食确实会影响大鼠掠食行为。

　　中枢神经系统多个脑区以及多种化学物质参与调控啮齿类动物的掠食行为。前扣带皮质位于前额叶的内侧部分，参与调控认知、学习、社会评估等复杂行为。前扣带皮质受到毁损的灵长类个体在强化介导的选择任务中不能正确地整合风险和回报。啮齿类动物前扣带皮质受损研究表明：前扣带皮质受损的大鼠放弃“付出越多得到越多”的行为，更愿意少花力气获得少的收入。李明波等研究表明：双侧前扣带皮质损毁后的大鼠掠食行为明显受损，其中竞争性掠食量下降*为明显。本研究结果显示高脂组大鼠的掠食量明显减少，推测高脂饮食大鼠掠食行为障碍可能与前扣带皮质功能改变有关。c-Fos蛋白作为参与细胞内信号转导功能的第三信使，其表达可反映神经元对某种刺激的活动情况，常被作为神经元激活的标志。本研究中高饮食大鼠在掠食过程中前扣带皮质内c-Fos表达明显减少，提示长期高脂饮食影响大鼠掠食行为的机制可能与前扣带皮质区神经元功能下降有关；具体的机制仍需进一步的探讨。