动物实验,胰岛分离纯化 中国实验动物信息网 2020-08-13 834

　　主要试剂

　　胶原酶V，512kut/mg（西格玛），DNase（西格玛），胎牛血清（Gibco），RPMI1640培养基（Gibco），葡聚糖（Pharmacia），汉克斯平衡盐溶液（Gibco）。

　　主要设备

　　离心机，注射器，显微镜，无尘工作台等。

　　实验室材料

　　成年杂种猪，年龄12个月，体重约150公斤，在从猪中屠宰并收集血液后，在相对无菌的条件下迅速将其胰腺取出，并在4℃的汉克斯氏溶液中储存在实验室中。发给。时间少于10分钟，冷缺血时间少于90分钟。

　　实验步骤

　　1.胰岛分离

　　取出胰脏并将其放置在超干净的工作台上，以快速去除胰脏周围的组织，脂肪，血管和手术包膜，以确保正确封装。握住膜。从胰头和胰体的交界处切开胰腺，找到主胰管，插入20G套管针，缝合缝合线，并切断尾巴的远端。每次收集约15-20 g组织，并在4°C注射含Ca2Hanks溶液的溶液制备的复杂胶原酶溶液（1.5 g/L，包括DNase 0.3 g/L），注射量=胰腺质量x 2 ，注入速度为7mL/min，在3-4分钟内完成，放入玻璃容器中，并在±0.1°C的水浴中以38.5 100r/min的振荡速度消化。在消化过程中，添加0.1 mmol/LaOH尽可能使消化pH保持在7.8。从消化开始，每4分钟取样20分钟。硫hydr染色的显微镜检查。消化胰腺组织并将其粉碎成细沙后，通过显微镜检查并在4℃下用冷的汉克斯溶液（含100 mL/L胎牛血清）从外分泌组织中排出大部分结构完整的胰岛。立即停止。消化并充分混合后，通过40目钢网过滤，收集消化的组织，并在4°C下离心两次以除去脂肪和其他异物以进行显微镜检查。取样并消化后观察胰岛分离情况。

　　2.胰岛纯化

　　使用Dextran制备密度为1.037、1.054、1.070、1.096、1.11 kg/L的不连续密度梯度溶液，并将不连续密度梯度溶液分别置于50 mL离心管中。加入10 mL，将*后洗涤的消化组织与每0.5 mL 1.037 kg/L密度梯度溶液中的10 mL混合，并小心地移至离心管中液体的上层，以形成不连续的密度梯度。做到了。将2-4个离心管放入冷冻离心机中，以800r/min的速度离心5分钟，然后以2500r/min的速度离心15分钟，离心后收集1.096-1.054kg/L纯化的胰岛，在4°C下洗涤两次。取样进行显微镜检查并分别计数以估计纯度，生物活性和组织学鉴定。

　　3.胰岛的数目和纯度的测定

　　用双硫zone（双硫10 10 mg，无水乙醇3 mL，250 g/L氨水50 mL）对分离和纯化的组织悬浮液染色，并用光学显微镜观察胰岛细胞簇。染色的猩红色或红色外分泌组织没有色素，圆形，椭圆形或不规则状。显微镜下计数直径大于50毫米的胰岛，并计算每克胰腺组织中分离的胰岛的当量。纯度估计为内分泌和外分泌组织量之比。

　　4.鉴定胰岛的生物活性

　　将纯化的胰岛细胞悬液置于显微镜下，并用巴斯德吸管将胰岛拉入培养板。相当于每10个岛（每个岛的直径等于150毫米）。将IE中的成年猪胰岛（API）置于一个培养孔中，并将六个孔分成一组，共四组。将每组置于含有5.6 mmoL/L葡萄糖（低糖）的无糖培养基中。 16.7mmoL/L葡萄糖（高糖），16.7mmoL/L葡萄糖+ 10mmoL/L茶碱（高糖茶碱）RPMI1640培养液，37℃，置于50mL/LCO2的培养箱中，孵育4小时，并在培养液中收集胰岛素使用放射免疫分析试剂盒（中国科学院原子能研究所）测量胰岛素含量。

　　5.胰岛组织学测试

　　离心和纯化后收集胰岛细胞悬液，收集胰岛组织，用无水酒精固定，并将切片包埋在石蜡中。 ，HE染色检查胰岛的结构完整性。

　　6.统计处理

　　将获得的数据表示为均值±SD，通过t检验比较组之间的平均差异，将P视为差异。