动物造模 中国实验动物信息网 2024-04-15 985

　　简介：年龄相关性黄斑变性、Stargardt病和视网膜色素变性是常见的RD疾病，常导致不可逆性失明。目前使用和开发的许多治疗方法，如基因治疗和营养因子，仅在宿主光感受器受损但仍然存活并可被挽救的早期疾病阶段发挥作用。当感光器不可逆地退化时，抢救治疗是不成功的。由于视网膜神经节细胞在重度感光细胞丢失后能够存活，目前*有效的治疗方法可能是取代感光细胞和其他视网膜细胞。大量的研究表明，到目前为止，胎儿供体组织已经成为中枢神经系统移植的一种非常有效的选择。进一步的研究表明，这也适用于视网膜移植替代退化视网膜的细胞。后来对移植的光感受器前体细胞进行移植的研究并没有报道任何令人满意的视力改善结果。怀疑这可能是由于低数量的感光体前体整合到视网膜中。分离的细胞移植具有优势，因为手术比骨料和片材的移植更简单。然而，分离的细胞不能形成层状组织，并且长期生存有限。细胞聚集体的移植可以形成花环而不是平行的叠层。以前的工作表明，一个退化的视网膜区域被一个有或没有RPE的胎儿板代替，在啮齿类动物中形成层状移植体。在大鼠RD模型中，大鼠胎儿视网膜片移植恢复了与视网膜移植位置相对应的上丘区域的视觉反应。在临床上，重要的是要知道是否将人胎儿视网膜片连同其视网膜色素上皮细胞移植到视网膜下空间。使用正常视力的裸免疫缺陷大鼠的研究表明，视网膜色素上皮移植与RPE在长时间存活后可以形成层状结构，这导致了*次临床联合移植试验。二期临床试验中，10例患者中有7例经视网膜色素上皮移植术后一年视力提高了。然而，视网膜移植后的视觉功能改善尚未在视网膜变性模型中被测试。由于*终的目标是移植在人类视网膜退化的患者，人类视网膜片移植的能力整合到剩余的主机架构和视觉功能恢复的程度，需要在动物模型中进行测试。与大鼠组织相比，人类组织以较慢的速度发展和成熟，因此需要延长实验分析所需的时间。目前的研究旨在解决这些问题。免疫抑制在移植大鼠等组织时普遍采用。然而，免疫抑制结果不可靠，并且可能对动物造成疼痛和损伤。例如，免疫抑制剂环孢素A可能具有肾毒性作用并降低RCS大鼠的视觉反应。因此，我们开发了一种具有FXN1-/-和Rho S334 Tor-／-Line -3视紫红质突变的双突变大鼠，该突变体既有免疫缺陷又有视网膜退化。这种大鼠模型在移植异种移植物时消除了免疫抑制的需要，也消除了同种异体移植物慢性免疫排斥反应。本研究在上丘（SC）的细胞外记录，评估了人类视网膜移植后RD裸鼠模型的视觉功能.. 采用OCT和免疫组织化学方法研究供体和宿主之间的移植物发育和相互作用。数据表明，人胎视网膜板移植可以改善大鼠视网膜变性晚期模型的视觉功能。

　　动物：动物在IVC笼具中饲养，温度为21.5±0.8°C和相对湿度为50%。SD TG（S334TER）3LAV大鼠与NTac:NIH-Whn 大鼠杂交获得SD-Foxn1 Tg(S334ter)3Lav （RD 裸鼠）。

　　供者组织分离和移植程序：人类胚胎眼（受孕后11至15.7周）是由HSCRO批准的来源获得的，在含B27补充剂的Hibernate E培养基中隔夜装运。在Hibernate E培养基中分离供体人视网膜，并按前面所述进行处理。在37°C下，供体眼在37度，10%中性蛋白酶作用下放置30～40min，使视网膜色素上皮和视网膜脱离周围组织。供体组织取自胎儿视网膜除黄斑外的不同区域，因为RPE在该区域容易分离。. 移植前，将一小片供者组织（平均0.7毫米×1.2μmm）插入定制的移植器械中。如上所述进行视网膜片移植。受体大鼠用氯胺酮（40～55毫克/公斤）/甲苯噻嗪（6～7.5 mg/kg）麻醉。扁平部后1mm切口，其次是局部机械性视网膜脱离。为了防止眼睑肿胀，在麻醉前，大鼠皮下注射酮洛芬（4毫克/公斤）。地塞米松滴眼液+丁卡因、阿托品治疗眼部常见病。捐赠者视网膜移植组织被交付到左眼视网膜下空间的使用自定义植入仪。切口以10-0缝线闭合。假手术只注射介质。为了恢复，大鼠皮下注射林格盐水溶液，然后放置在热护理培养箱中恢复。手术组用倍他丁和三联抗生素软膏（新霉素/杆菌肽/多粘菌素）治疗。疼痛管理，动物也接受丁丙酯（0.03 mg/kg）镇痛。

　　OCT: 如前所述，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉大鼠，用阿托品扩瞳，用PixiGEN EnVISU-R2200光谱域眼科成像系统获得视网膜的SD-OCT图像。移植大鼠从术后2周开始每1～2个月进行一次成像，*后一次扫描尽可能接近末端实验（SC记录）。

　　组织学与免疫荧光：用冷4%多聚甲醛的0.1μm磷酸钠缓冲液中灌注大鼠。摘取眼球并包埋。制作冷冻切片，并对其进行HE 染色。

　　上丘（SC）电生理学：如前所述，来自SC的视觉响应被记录下来。简而言之，从6.6个月至9.5个月龄（手术后5.8个月至8.6个月）记录移植的RD裸鼠的反应，并与年龄匹配的非移植性裸鼠和假手术大鼠的反应进行比较。从SC表面的50-60个位置进行多单元电生理记录，大约200～400μm。每个位置，光刺激（20毫秒持续时间）在0.58 到 ?6.13 log cd/m2的强度下以10秒的间隔递送约10次。为了检测响应阈值，当发现响应时，光刺激的强度被降低，直到没有响应。

　　结果：人胎儿视网膜的发育与鉴定：胎龄11～15.7周（WKS），从五例胎儿中分离出供体组织。组织中的细胞是视网膜祖细胞，它们仍然在发育。在孕周12周的组织中，强的CHX10染色显示整个神经母细胞层中的视网膜祖细胞。神经节细胞层通过强的MAP2（微管相关蛋白2）染色和NeuN（神经元核染色）显影神经节细胞。一层分化的锥体感光体，在外神经母细胞层（NBL）中被视网膜RAX和OTX2抗体强烈染色。在这个阶段（12周）没有视紫红质染色。RPE对OTX2也有免疫反应性。在11周，只有1层显影感光细胞在外NBL中染色，但在15.7周时被恢复。15.7周OTX2和CHX10在视网膜内NBL共表达。

　　OCT：22只大鼠成功移植十三只。移植可通过OCT检测，如图2中OCT所示，移植后1个月的人胎视网膜片移植不成熟，只有IPL和外神经母细胞层可识别。术后约3个月，移植发展成可见层视网膜层。移植保持相同的结构直到实验结束，并且在某些情况下可检测到外部节段。有时看到叠层和花环的混合物。

　　光受体：移植到视网膜下间隙后，胎儿视网膜片发育成熟，成层状结构，可识别为IPL、INL、OPL和ONL层。在手术后6个月，移植体中可见成熟的感光细胞。Revivin染色显示部分移植层有明显的感光层。虽然大多数移植形成玫瑰花结结构（球状排列的视网膜层，以感光器为中心，n＝7/13），花环内的层叠仍然是明显的。在宿主中没有视紫红质或锥体转导蛋白染色，表明在受试时间（5.8～8.6个月）的宿主中光感受器完全丧失。

　　双极细胞：为了研究杆状和锥体双极细胞，分别使用PKCα和分泌素抗体。如图5所示，在宿主视网膜中发现了强PKCα阳性的双极细胞。移植后PKCα和SC121（人细胞质标记物）的共定位表明，供者祖细胞在移植后发育为成熟的杆状双极细胞。即使在一些仅形成玫瑰花结的移植体中，花环与宿主杆双极细胞非常接近，并与宿主结合。同样，在移植后，移植中的一些细胞发育成分泌促分泌素的锥体双极细胞。与杆状双极细胞相比，移植的锥体双极细胞比宿主少很多。

　　上丘（SC）电生理记录评价视觉功能的改善：在移植后5.8～8.6个月，用电生理记录法对移植后的大鼠进行视觉电生理分析。七只移植供SC电生理记录的移植大鼠中，四只显示在移植后SC的有限区域内对闪光（0.58 log CD/m2）的响应。相反，年龄匹配的假手术大鼠或年龄匹配的对照非手术大鼠没有闪光反应。

　　结论：这项研究表明，移植的人类胎儿视网膜片在严重退化的环境中继续发育和分化成成熟的视网膜细胞，并通过与宿主视网膜电路直接连接来改善视力。这些发现为使用胎儿视网膜片移植作为恢复视力的治疗策略提供了重要的启示。伦理上获得的胎儿视网膜可用于改善RD患者的视力，而其他方法如干细胞移植仍在开发中。