动物造模 中国实验动物信息网 2022-08-26 1004

　　简介：急性跟腱断裂的手术治疗包括早期加速康复这缩短了固定期，允许早期范围运动和肌肉强化练习。使用这种方法，多项研究表明损伤后即刻负重能力。实验模型表明，早期断裂和加载的断跟腱促进胶原纤维的组织成熟。跟腱断裂不仅可以通过机械刺激来治疗，例如早期负重和运动范围的锻炼，还可以通过生物方法如生长因子治疗来治疗。肌腱愈合包括相互依赖和重叠的炎性、增殖性和重塑期。在初始炎症期，红细胞和炎性细胞进入损伤部位，坏死组织被单核细胞和巨噬细胞吞噬。生长因子被释放，这反过来又刺激成纤维细胞的血管生成和增殖，迁移到损伤部位并引发III型胶原合成。增殖期在几天后开始，此时，III型胶原合成是*大的，并且保持大约6周的升高。在随后的重塑阶段，合成I型胶原的比例较高，腱细胞和胶原纤维在应力方向上排列。富含血小板血浆（PRP）包括自体血液，血小板浓度高于基线值。PRP可通过递送α颗粒中含有的多种生长因子，促进细胞的增殖、趋化、细胞分化和血管生成，从而促进愈合过程。据我们所知，PRP对肌腱愈合的三个阶段（炎性、增殖性和重塑期）的影响还没有被研究。本研究旨在通过组织学检查和定量评估来评价PRP对三个阶段兔跟腱愈合的影响。我们假设PRP治疗通过刺激成纤维细胞增殖和胶原生成促进组织愈合，从而加速重塑过程。

　　材料和方法：雄性日本白兔（n＝50）重3公斤，温度22～24℃，12～12小时光/暗循环，自由饮水和采食。

　　PRP的制备：雄性日本大白兔四只，用于PRP生产。根据制造商的使用说明通过自体血小板系统制备PRP。

　　跟腱断裂模型：如前所述，建立跟腱断裂模型8只，用戊巴比妥钠（20 mg/kg体重）麻醉兔，右后肢皮肤剃毛。在无菌条件下进行手术。在跟腱的中线做纵向皮肤切口。与皮肤切口相同的方向切割副韧带，从周围组织解剖跟腱和跖腱。跟腱的总长度约为3厘米。在跟腱的中部切断。跖肌腱作为一个内部夹板保持完整，保持很短的距离（0～1毫米）。切断肌腱不缝合。将家兔随机分为两组，每组25只。对照组仅行跟腱断裂；PRP组在肌腱切断后立即将0.3克PrP置于肌腱残端的前方。然后缝合副韧带和皮肤。手术后，通过经皮插入，将踝关节在60°跖屈固定。用石膏补充固定。都用传统的钢丝网笼进行观察。术后一直保持固定，直到获取跟腱。

　　组织学检查：术后1, 2, 3、4、6周取跟腱。在对照组和PRP组中，每次取样标本的数量为5。将组织固定在20%缓冲中性福尔马林中3天，脱水，然后包埋在石蜡中。肌腱纵向切片用苏木精和伊红染色（H＆E）。免疫组化法将跟腱在纵向平面上切片，厚度为7μm。。切片用抗内皮细胞分化的CD（31）单克隆抗体和Ⅰ型胶原孵育。使用EnVIEW SUV+试剂盒进行免疫组织化学染色。切片用Mayer的苏木精复染。通过评价H＆E染色结果，比较两组肌腱愈合过程。I型胶原免疫反应用评分系统进行半定量评价。通过分析配备DP72数码相机的BX50光学显微镜采集的跟腱残端之间间隙的图像来量化H＆E染色结果和CD31免疫反应性。400倍放大对10个场，通过计数成纤维细胞的数量来评估增殖。为了评价血管生成，我们使用LuMaVIEW V.2图像分析软件在100倍原始放大率下测量CD31阳性细胞在10个区域中的面积比。

　　结果：全血中血小板平均浓度为40.6±9.6×104/μL，血小板平均血小板浓度为105.7±22.8×104/μl，比全血大约2.6倍。术后1周，PRP处理和未处理兔断肢跟腱之间的缝隙填充有成纤维细胞、血细胞和纤维蛋白。然而，没有观察到胶原纤维密度的增加。对照组2周时胶原纤维稀疏；然而，在PRP组中，纤维和毛细血管的致密地存在于间隙中。3周时，两组胶原纤维密度均增加。在4周时，纤维束不沿腱轴定向，成纤维细胞在对照组中继续增殖。相反，在PRP处理的兔子中，胶原纤维束在平行于肌腱长轴的单一方向上排列。在6周时，胶原纤维束沿腱轴部分定向于对照兔。在PRP处理的兔中，胶原纤维束沿着肌腱轴平行排列，并且它们接近正常肌腱中的纤维。从第1周开始，两组的成纤维细胞迁移逐渐增加，但在1周和2周时PRP组的成纤维细胞比对照组更多。3周时，对照组的成纤维细胞数量高，但在PRP处理的兔中，在3周和4周时，成熟的细胞扁平化的细胞核比纺锤形细胞核增生的成纤维细胞多。表明未成熟成纤维细胞数量减少。在4～6周时，成纤维细胞增殖在对照组中持续，但在此期间，成纤维细胞的数量明显减少，在PRP组中观察到更多扁平细胞核的成纤维细胞。在PRP处理的家兔中，成纤维细胞数在6周时显著低于2周时。而对照组在6周时持续增加。直到第2周，两组均未观察到I型胶原免疫反应性。在3周时，PRP治疗组的信号强度高于对照组（评分为3比2），表明此时肌腱前者较成熟。因此，4和6周的I型胶原免疫反应评分分别为对照组的2和3，而PRP处理的兔的I型胶原免疫反应评分分别为3和4。在1周和2周时，PRP组血管增生明显高于对照组。对照组血管直径在3周和4周时增加，血管数目也增加。在这个时间点，PRP组血管直径和血管数量减少。在6周时，对照组血管直径较小，散布在整个愈合肌腱上。然而，在PRP组中，仅在胶原纤维束之间观察到血管。PRP组CD31阳性细胞面积在1周和2周时明显高于对照组。在3, 4周和6周时，两组间的面积比相似。PRP组在2周时达到峰值，但在6周时仍保持较高水平。

　　结论：PRP给药可缩短炎症期，促进肌腱在增生期的愈合。重塑阶段开始较早PRP治疗，促进肌腱组织的早期愈合。研究结果表明，PRP联合早期功能康复治疗可促进跟腱愈合，无需肌腱延长或再断裂，从而减少工作或体育活动所需的停工时间。