动物模型 中国实验动物信息网 2020-08-10 911

　　在临床上，再生障碍性贫血（AA）是一组造血组织衰竭综合征。大多数患者是中年，急性病例的预后很差。仅慢性，轻度病例可以缓解或治愈。再生障碍性贫血的原因尚未完全了解。主要原因是由于机体骨髓多能干细胞和微环境的破坏引起的一系列功能和形态变化，进而导致全血细胞减少。可能的原因包括物理，化学和生物学因素。另外，人体的免疫因子在这种疾病的发生和发展中起作用。再生障碍性贫血患者的主要临床表现是反复性贫血，出血和感染。三种类型的血细胞同时减少，肝脏和脾脏或淋巴结没有肿大。

　　1、物理刺激法

　　（1）复制方法一次以7.0 Gy的60Co-γ射线照射成年小鼠，照射距离为2 m，照射剂量率为2.275 Gy/min，并成功复制了AA动物模型。

　　（2）功能模型物理辐射可导致体内严重的造血功能障碍，可损坏模型动物的各种组织和器官，并具有明显的副作用。当使用60CO-γ全身辐射创建模型时，过多的短暂生殖器损伤会导致模型小鼠的死亡率很高。如果瞬时损伤太轻，则小鼠的造血功能会自然恢复，并且会影响建模效果。因此，尽管模型制备方法简单且易于操作，但是正确选择辐射剂量是成功制备模型的重要因素。

　　（3）比较医学放射致死或致死剂量的X射线或C射线会大大损害小鼠的造血功能并减少外周血细胞。该疾病的特征在临床上与人类急性再生障碍性贫血相似，并且可用作实验研究的再生障碍性贫血动物模型。

　　2、化学诱导方法

　　（1）复制方法将马里兰制成蒸馏水的0.05％悬浮液，并以4 ml/kg体重的胃内给药连续45天。给予模型小鼠45天后，与正常小鼠相比，大多数小鼠的外周血白细胞，血小板和血红蛋白可能减少1/3或更多，并且小鼠股骨中的多能造血干细胞减少。该数字仅为正常小鼠的约40％。 ..

　　（2）模型的特点建立模型的方法简单可靠，马里兰等药物的作用明显，但建模时间比物理刺激法长，它可能会对骨髓造成永久性损害。 （3）比较医学Marilan可以损害模型动物中的造血干细胞，显着减少造血干细胞的数量，并延迟自发恢复。该模型适用于研究再生障碍性贫血的药物治疗和药物筛选。

　　3、免疫介导方法

　　（1）复制方法将16至20 g和8至12周龄的BALB/c小鼠用作受体，将8至10周龄的DBA/2小鼠用作供体。小鼠的类型也可以是雄性或雌性。取出DBA/2鼠标并通过颈脱位法将其杀死。通过在95％乙醇中浸泡5分钟进行灭菌，然后从胸腺，腋窝和腹股沟中无菌去除淋巴结，然后添加RPMI-1640培养液以去除表面血迹和附着的结合物。 ..再次清洗组织后，用手术刀反复切割组织直到其变成糊状，然后轻轻地压碎并用200目尼龙网过滤，得到单细胞悬液。计数后，浓度为1x1000000000/L，胸腺细胞与淋巴细胞之比为1：2、取一滴锥虫蓝并将其滴在载玻片上，以确保细胞活力在95％以上。用6.0 Gy的γ射线辐照BALB/c小鼠3分钟，并在亚致死辐射后的1至4个小时内，用0.2 ml /小鼠用注射器从小鼠尾静脉立即注射上述细胞悬液。做到了。创建再生障碍性贫血的动物模型。

　　（2）模型表征以这种方式复制的AA模型更稳定和可重现，但是制造方法更复杂，需要更*的制备条件，并且模型动物的死亡率更高。相对较高，通常所有动物在12-14天内死亡。因此，它适合于短期急性再生障碍性贫血的实验研究。如果您在药效学研究中使用它，尤其是在中药中，则研究时间将受到限制。

　　（3）在比较医学中应用免疫介导方法建立的再生障碍性贫血小鼠模型模型，临床模型，外周血和骨髓变化与临床再生障碍性贫血患者基本相似。是一样的。在体内造血功能的许多负调节剂中，IL-2和TNF的异常升高可能对CFU-GM的产生具有明显的抑制作用，因此始终是人类免疫介导的。据认为与再生障碍性贫血有关。造血抑制活性的形成是紧密联系的。因此，该模型适用于与免疫因子相关的急性再生障碍性贫血的实验研究。

　　4、复合诱导方法

　　1.环磷酰胺加氯霉素诱发的再生障碍性贫血动物模型

　　（1）复制方法雄性KM小鼠约20g，6至7周大，60Co-在以3.0Gy的γ射线照射后的第4天给予50.0mg/kg体重的环磷酰胺（CY）和62.5mg/kg体重的氯霉素（CH），并连续给药3天。在抗凝治疗后，在给药后第8、12和16天对小鼠放血以进行常规血液检查，并在第8天处死小鼠。收集左股骨，用布恩氏溶液固定，并用硝酸脱钙，以恢复常规。在光学显微镜下观察组织切片。

　　（2）模型的特征：模型小鼠的外周血白细胞，血小板和血红蛋白在第8、12和16天显着低于正常小鼠。显微镜下的组织病理学观察显示，模型小鼠的骨髓增生非常低，造血细胞减少（造血细胞数量少于20％），骨髓中的脂肪细胞没有变化，如间质性水肿，窦性扩张和巨核细胞。再生障碍性贫血的特征。该模型制造简单，复制周期短，成功率高，动物死亡率低。缺点是模型小鼠的造血功能可以在第25天正常恢复。当用作研究的AA模型时，应在约20天之内处死动物，并且对各种指标进行测试是理想的。

　　（3）在该模型建立方法中，比较药物CY是烷基化剂。 CY具有细胞毒性作用，抑制体细胞中的DNA合成，并且对造血系统敏感。它可以缓慢但持久地抑制模型动物的骨髓。 CH还抑制体内的骨髓生成，导致体内的AA。伽马射线可影响人体的DNA复制，抑制细胞有丝分裂，减少造血干细胞并影响人体的免疫功能。

　　2.环磷酰胺加甲苯诱发的再生障碍性贫血动物模型

　　（1）复制方法我们使用重约20g，6-8周大的KM小鼠。建模前一天，对模型动物的局部皮肤进行消毒后，通过尾切血液采样方法确认血液图像，从小鼠眼眶收集血液并压在血膜上，用黄色焦油蓝染色，并网织红细胞计数。并记录动物的血红蛋白（Hb），血小板（PLT），红细胞（WBC），网织红细胞（RET）的细胞计数。第二天，每天一次向小鼠皮下注射环磷酰胺溶液，共4剂，剂量为50 mg/kg体重。同时，将小鼠放在圆筒中并吸入甲苯。甲苯浓度为30 mg/L。每天一次从模型动物中采集血液，每次2小时，共8次，10和35天的暴露时间，并观察到血液图像和网织红细胞。在建模的第11天，一些小鼠死于颈椎脱位。用Bouin溶液固定骨髓（股骨和胸骨），用10％甲醛溶液固定脾脏，肝脏和其他器官组织，并用石蜡包埋以制备常规组织切片。 HE染色，在光学显微镜下观察。在建模的第35天测量其余模型小鼠的血液图像，以观察耳廓微循环（戊巴比妥钠麻醉剂量为30 mg/kg体重，动物耳廓小动脉和微循环在循环显微镜（静脉口径）下观察，处死动物并收获骨髓和脾脏以进行组织病理学检查。外周血三态细胞减少，网织红细胞减少，骨髓活检显示减少的骨髓增生，增加的非造血细胞和脾萎缩。

　　（2）模型特征已经建立了再生障碍性贫血的动物模型并将其用于实验研究中。建模方法主要包括化学方法（例如环磷酰胺，马里兰，苯）和物理方法（例如反复暴露）。 ，放射性同位素89Sr，32P等的注射）和生物学（免疫介导）方法。环磷酰胺是一种烷化剂，可通过抑制体内细胞的DNA合成并减少全血细胞数量而具有细胞毒性作用。在临床环境中经常接触甲苯（或苯衍生物）的许多人，例如喷漆器，制鞋匠，印染工人，都容易患此类疾病。使用环磷酰胺和甲苯化合物的方法创建再生障碍性贫血的动物模型与该疾病的常见原因是一致的。易于创建模型，复制周期短，模型成功率高。当仅使用环磷酰胺建立模型时，模型动物外周血中的白细胞数量显着减少，而红细胞的数量则缓慢减少（但不是显着），并且模型周期短。您可以看到它已经成为。单独使用苯可减少动物体内的总血细胞，并缩短周期。例如，辐射建模优于环磷酰胺，在每个系列中都有更明显的降解和更长的维护窗口。但是，控制剂量并不容易。文献中有报道说，可以使用几种方法共同创建模型，例如60CO-环磷酰胺-乙酰吩嗪，以减少快速稳定的外周血红细胞的数量。然而，实验要求严格且笨拙，并且不易于广泛使用。

　　（3）比较医学临床再生障碍性贫血（AA）是一种以造血干/祖细胞增殖，分化受损或造血微环境异常引起的造血组织衰竭为特征的疾病。再生障碍性贫血的病因很复杂，患者通常会经常接触化学物质，放射线或自身免疫性疾病。用这种方法复制的模型动物表现出全血细胞减少，网织红细胞耗竭，骨髓性干细胞耗竭，非造血细胞成分增加，脾萎缩，出血和感染，类似于人再生障碍性贫血的临床症状。可用于人类再生障碍性贫血的病因学研究，药物治疗和药物筛选。

　　3.环磷酰胺和60Co-γ射线和乙酰吩嗪诱导的再生障碍性贫血的动物模型

　　（1）复制方法BA1B/c小鼠，体重18-22g，6-8周大，有60只BA1B/c小鼠。在建模的*天，给小鼠皮下注射乙酰苯肼（APH），剂量为80 mg/kg体重。在第二天，用2cGy的60Co-γ射线辐照模型小鼠。辐射后三天，以50 mg/kg体重的剂量腹膜内注射环磷酰胺（CY）。在每个规定时间内从每只小鼠收集血液用于外周血检查，并通过颈脱位法处死小鼠。无菌收获小鼠的股骨，并使用2ml IMDM培养基将骨髓细胞洗去以制备单细胞悬液。核细胞（BMC）计数。在第7天使用小鼠骨髓细胞进行细胞培养，以准备培养系统。接种细胞并在CO 2培养箱中培养，并且在7天后，计数CFU-GM，BFU-E和CFU-Meg集落的数量。

　　（2）模型的表现模型化后第7天进行外周血检查，发现3个系的外周血细胞明显减少，骨髓抑制期为15天。尽管建模后BMC的数量减少了，但是小鼠的骨髓有核细胞（BMC）的数量在第7、11和15天趋于逐渐增加，这表明骨髓抑制可以随着时间的推移逐渐恢复。我是。当在成形后第7天培养造血祖细胞时，集落产量降低，并且CFU-GM，BFU-E和CFU-Meg的数量显着低于正常对照动物。通过这种方法再现的再生障碍性贫血模型在外周血图像协同下降的水平和骨髓抑制的持续时间方面具有优异的特性，并且该模型的再现方法简单且易于实现。周期短。结果稳定，可靠，可以用作更好的AA模型。

　　（3）比较医学AA的病因很复杂，患者通常与化学药品，放射病和自身免疫性疾病有关。因此，建立良好的抗AA动物模型对于进一步研究再生障碍性贫血的病因和药物治疗具有重要意义。当前，有很多不同的AA动物模型建模方法，所有方法均具有不稳定的再生障碍性贫血，谱系减少不一致，繁琐的建模方法以及周期长的缺点。但是，此模型使用复合建模方法。模型动物的特征是外周血红细胞数量迅速减少，稳定周期长等。环磷酰胺可以与细胞DNA交联，这是用于复制AA动物模型的*常用的细胞周期非特异性药物。它抑制DNA合成，其细胞毒性作用很强，并且由它引起的骨髓抑制作用迅速且基本上可逆。 60Co-γ射线会引起细胞DNA损伤，干扰DNA复制，阻断有丝分裂并抑制细胞生长。作为一种缓慢的氧化剂，乙酰吩嗪可引起红细胞膜损伤并减少外周血红细胞的数量。可以看出，当仅使用环磷酰胺建立模型时，模型动物外周血中的白细胞数目显着减少，但是红细胞数目并未缓慢且显着减少。考虑到动物外周血中成熟的红细胞不受环磷酰胺的影响，其生存周期较长，并且暂时藏在模型动物体内。骨髓抑制；该模型的复制周期短，这限制了对红细胞的进一步观察。仅辐射的建模结果优于环磷酰胺模型的结果，每个系列的降解更为明显，并且模型的维护周期更长。但是，控制辐射剂量并不容易，并且很容易影响小鼠死亡率和模型复制效果。该模型的特点是外周血红细胞数量迅速减少，周期长且稳定，但存在专用设备，专家和繁琐的复制过程等缺点。与其他常用的复制AA动物模型的方法相比，它仍然具有简单，有效和稳定的特性。