CRISPR/Cas9技术,免疫缺陷小鼠 中国实验动物信息网 2021-06-21 1479

　　目的：利用CRISPR/Cas9技术，靶向敲除编码小鼠T细胞和B细胞的Rag2基因和编码NK细胞的IL2rg基因，构建结合T、B、NK细胞的免疫缺陷小鼠。

　　方法：根据Genbank报道的Rag2和IL2rg基因序列，为这些外显子设计合成了大约25bp的sgRNAs，退火后克隆到pX330载体中。ag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA、Cas9重组质粒体外转录成mRNA，显微注射BALB/c小鼠的受精卵细胞，将受精卵细胞移植到受体动物体内，建立*只小鼠（F0）。并通过交配获得野生型F1代小鼠，突变F1代小鼠交配后筛选出F2代纯合小鼠。通过基因测序、流式细胞术和接种人肿瘤细胞系检测后代小鼠的基因型和表型。

　　结果：成功构建并体外转录了Rag2-sgRNA和IL2rg-sgRNA重组质粒。显微注射和移植mRNA后，获得57只F0小鼠。连续交配后获得F2代纯合小鼠。序列分析表明，后代小鼠有两种基因型，IL2rg，是10bp和11bp的缺失突变，而Rag2只有一种基因型，是8bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比，小鼠外周血CD3、B220、NKp46阳性细胞数量明显减少。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后，肿瘤生长良好，肿瘤组织随时间逐渐增大。

　　结论：利用CRISPR/Cas9技术可以有效实现BABL/c小鼠Rag2和IL2rg基因的突变，导致小鼠T、B、NK细胞功能异常。