动物实验 中国实验动物信息网 2021-06-09 838

　　免疫系统功能多样，能够对数百种不同类型的传染病做出精细的反应。对感染后免疫应答的启动需要先天性免疫细胞（这是识别的一般功能的病原体）和适应性免疫系统的淋巴细胞（其高度可变的抗原受体能结合特定的病原体）之间的合作。T淋巴细胞的活化依赖于抗原递呈细胞（APCs）先天性免疫系统直接由病原体激活，将病原体吞噬和反刍后，再呈递给活化的T细胞。T细胞增殖，分化保护身体，通过激活其他免疫细胞或杀死受感染的细胞。由T淋巴细胞激活的免疫细胞中，*重要的是B淋巴细胞产生抗体的。T淋巴细胞决定B淋巴细胞分泌的的抗体类型，和其他免疫细胞的活性，从而指导免疫反应，提供*佳地保护对抗不同类型的感染。

　　在免疫反应结束时，大多数的活化B细胞和T细胞都会发生凋亡，但有少量留作记忆细胞，在宿主暴露于相同的感染的情况下做好免疫防御。疫苗必须以类似的方式工作，启动抗原特异性T细胞和B细胞，其中一部分转换为记忆细胞，将通过疫苗这个入侵者控制继发感染。此外，类似感染本身，疫苗必须产生*佳的类型的免疫反应，来对抗特定的病原体。

　　对免疫系统对抗抗原的不同方法进行简要总结， T淋巴细胞分为两大类，细胞毒性（CD8）细胞和辅助性（CD4）细胞，和他们的主要行动。例如，病毒感染可以通过细胞毒性T细胞（CTL）或抗体清除，而细胞内的细菌和寄生虫是*有效的控制通过T细胞产生的细胞因子，专门来激活特定的先天性免疫细胞。免疫系统被认为能识别不同类型的病原体，通过识别先天免疫细胞对微生物病原（PAMPs）相关分子机制。可以使反应细胞通过这些途径直接获得适应性反应来更好的抵抗微生物入侵。PAMPs包括，例如，细菌细胞壁的组成特点，双链RNA，它在某些病毒中发现，和富含CpG的DNA，它可以存在在于细菌和病毒中。通过与生俱来的信号模式识别受体（PRRS）检测这些微生物成分，*有名的和*通用的是Toll样受体(TLRs)。TLR家族的膜结合受体的不同成员专门检测不同类别的病原体。此外，在天然免疫过程总许多细胞质蛋白*近被公认为是重要的物质，如PRRS。通过反应细胞对PAMPS的识别促进天然免疫细胞和抗原呈递APCs细胞募集并激活抗原呈递APCs细胞。提高抗原的吸收和诱导细胞表面分子和可溶性介质，这是T细胞活化所必需的。这些效应影响T细胞和B细胞反应的大小和及产生的记忆细胞的数目。它们不仅可以用来警告和激活获得性免疫反应的细胞，重要的是，它们还可以控制以下的免疫应答类型。

　　目前，人类中使用三种主要类型的疫苗：减毒活疫苗，由细菌和病毒组成，类似于真正的病原体但比其致病性少；灭活疫苗，热灭活或化学灭活病原体的粒子；亚单位疫苗， 由病原体成分制成。疫苗不仅含有抗原（抗原是获得性免疫应答的目标）。但是能产生无论是分子或其他物质能放大或影响获得性免疫反应，这些被称为佐剂。在减毒活疫苗，抗原是由获得性免疫系统细胞识别的再加上PAMPs能激活专门的抗原呈递细胞。正如病原体本身一样，也因此提供了一种天然佐剂。通过对比亚单位疫苗包括纯化的抗原，淋巴细胞特异性识别的。虽然它们比整个机体疫苗更安全，但据我们所知，它们不是，激活免疫系统的*佳疫苗，因为他们缺乏内在PAMPs的识别。这种疫苗需要增强佐剂来增强免疫原性，影响自然免疫的幅度与响应。

　　佐剂可能通过招募专业抗原呈递细胞到接种部位，促进免疫反应。通过增加抗原呈递给APCs，或通过激活细胞产生细胞因子及提供T细胞活化信号。在人类疫苗历史中有一个长期的使用的佐剂是铝盐（有时也被称为明矾）。来自病原菌的蛋白质吸附到铝盐，创造了一种悬浮液，通过肌肉注射免疫。尽管它在人类的疫苗长期和广泛的使用，仍然不明确它是如何辅助的。虽然人们普遍认为，铝佐剂是通过缓慢释放抗原来维持免疫反应。现在很清楚，他们对先天免疫系统的影响是多方面的。此外，切除铝佐剂使用后导致的结节，对免疫反应没有影响，对铝佐剂缓释功能提出了质疑。

　　*次有意将佐剂引进疫苗后结果表明铝盐和其它颗粒能增强机体的免疫反应。目前，很少有许可的疫苗佐剂用于临床。在美国，铝盐已经很多年了，可以说铝盐是人类疫苗使用的唯一佐剂。*近，单磷酸脂质A（MPL），是高度免疫原性细菌的细胞壁成分脂多糖（LPS）的衍生物，已被批准用于葛兰素史克疫苗，人乳头状病毒HPV与氢氧化铝的疫苗使用。在欧洲，使用一些其他的佐剂，包括水和油佐剂MF59 和AsO3，分别由诺华和葛兰素史克研制。除了这些，大量的新型疫苗佐剂已在实验室被研究，它们中的一些人也被用于人类临床试验。这些佐剂是否会通过两大标准通用要求（有效性和安全性）仍有待确定。

　　佐剂和抗体生产：大多数目前的疫苗是通过诱导长寿命的浆细胞-末端分化的B细胞它们能在相当长的时间内不断分泌抗体。在发生机体损伤之前，抗体快速行动，从而阻止病原体，或病原体的产物。因此对控制许多疾病他们是理想的，包括病毒感染和一定数量细菌产物产生的毒素，包括破伤风和白喉毒素。许多病毒疫苗使用减毒病毒作为代理，并能产生良好的，持久的抗体。然而，对于亚单位疫苗这不是真的。例如，破伤风疫苗，它是由一个类毒素（一种保留其抗原性的灭活毒素）吸附到铝佐剂，导致产生抗破伤风毒素抗体的细胞的产生。然而，这种疫苗常规是给每10至15年给个体注射，产生特定的浆细胞，其一直产生抗体直到死亡。活的麻疹病毒感染后的浆细胞被预测有3014年的半衰期。感染如何控制和如何使一个佐剂可以实现这个仍然是不清楚的。产生的抗体的类型也受到佐剂影响。这有不种不同性质的抗体，理想的情况下，疫苗应该被设计用来诱导这类抗体，这将是处理病原体*有效的方法。免疫球蛋白A（IgA）通过粘膜表面，是非常有效的抗感染物，这一因素可能是（减毒活疫苗）比沙克（灭活）脊髓灰质炎疫苗更有效的的原因。这是因为口服活疫苗诱导的肠道和呼吸道IgA的分泌，而灭活肌肉注射的沙克疫苗不能诱导其分泌。佐剂可选择以提高分泌IgA的产生，可能是通过对APC和T细胞分化的影响来达成。

　　抗体有时是不够的：流感疫苗通过诱导抗体对抗病毒的主要表面蛋白与血凝素和神经氨酸酶。在这样做时，他们可以有效地保护机体防止流感病毒株的感染，疫苗中存在表达这些蛋白的物质。然而，血凝素和神经氨酸酶这两种蛋白质的变化作为一个突变，疫苗必须每年重新重组包含预期株的血凝素和神经氨酸酶。此外，在美国目前没有使用佐剂的疫苗已成为历史。这意味着，必须给予大剂量的免疫并且对新兴的菌株中发现的蛋白质很难诱导免疫，如那些在H5N1病毒引起的禽流感。这可能是因为有记忆细胞，可以识别的病毒，但不能识别新兴的病毒株。记忆细胞在高水平的协同刺激缺失的情况下作出反应。因此，可以在没有佐剂的情况下被激活。然而，防止新出现的病毒株由于其每年的流感病毒株抗原性不同一个主要的反应是必需的。在缺失佐剂诱导的炎症的情况下，这种原发性反应不能被激活。流感疫苗添加佐剂（MF59、AsO3或铝盐；表1）能增加抗体滴度和持久性。然而，这些方法不对不同亚型的病毒提供交叉反应的。流行性感冒病毒亚单位疫苗FluMist衰减是真实的，它也是每一年都修改，尽管该疫苗可激活交叉反应性CD8 + T细胞，至少在孩子上可以。CD8 + T细胞识别病毒的不可变部分-例如，核心蛋白。并可以提供更多的交叉反应，可以被新的疫苗诱导。除了流行性感冒外，还有许多其他的传染病、艾滋病和疟疾，例如，它们的抗体不是全部，或是不够的提供充足的保护。在这些情况下，体液免疫，抗体介导的，和细胞介导的免疫力，这取决于通过细胞因子激活免疫细胞，细胞毒性T细胞或T细胞，可能有有效的保护。

　　T细胞启动佐剂的贡献：树突状细胞（DC）是在T细胞反应的开始主要的抗原呈递细胞，因而它可能是佐剂发挥效力的主要目标。在无感染的情况下，树突细胞是分布在整个组织作为吞噬细胞。这些细胞发出感染的存的信号，通过模式受体（PRRs）识别微生物成分，和间接地，通过天然免疫细胞释放的炎性细胞因子识别微生物成分。这些信号激活的树突状DC要经历一个过程称为成熟，并迁移到二级淋巴器官，在这里激活初始T细胞。DC成熟涉及增加处理的微生物蛋白。其中的部分呈现给T细胞上的主要组织相容性复合体（MHC）分子（下面讨论）。这是所需的*激活信号。此外，由PRRS引起的DCs活化导致DC表达即所谓的共刺激分子的细胞表面和细胞因子分泌。共刺激信号是第二信号，需要DC激活幼稚T细胞和细胞因子，提供第三信号，沿着不同的途径直接分化。一种方式，如铝盐佐剂MF59行为通过促进炎症和DC浸润到接种部位并提高DCS对相关抗原的摄取。

　　佐剂效果比较好理解的是作为信号，诱导辅助T细胞1（Th1）反应，它的特点是辅助性T细胞能产生高水平的IFNγ，和其他细胞因子，在效应部位能激活抗菌效果。这些Th1驱动信号是已知的通过TLR来诱导分泌白细胞介素（IL）12，它能诱导Th1细胞分化。佐剂QS21或其他皂苷类驱动Th1反应，被认为是在DCS中通过IL-12的感应来工作的。铝盐，但不直接通过Toll样受体引起信号和不通过DCS刺激IL-12的生成。相反，铝佐剂驱动Th2反应机制，是不太好理解。

　　为CD8 + T细胞（产生细胞毒性细胞）递呈抗原的要求，不同于那些CD4辅助性T细胞。CD8+T细胞是专门监测抗原，如病毒，它们入侵入细胞质，从细胞质中的抗原到达表面的途径是不同的，区别内在抗原的途径。简而言之，所有的抗原通过MHC分子的编码被呈递到细胞表面。内化抗原是通过一类MHC分子被运送到细胞表面，MHC II类能促进CD4细胞活化。相反，内源性抗原到达细胞表面上通过不同的分子，MHC I类分子能激活CD8细胞。激活细胞毒性T细胞， DCs内化抗原出现在细胞表面之前必须通过MHC I类途径。一种称为交叉呈递的过程，DC的抗原决定簇是特异的。佐剂系统可能对抗原交叉呈递过程有重要的影响。例如，某些TLR配体，如脂多糖，能促进对MHC I类抗原加工途径到内化囊泡途径的的重要组成部分运输，大概是增加交叉呈递。其他的佐剂，如免疫复合物，微粒佐剂由脂质、胆固醇和皂苷佐剂Quil A组成，通过旁路抗原加工途径可以促进交叉呈递和CD8细胞活化。

　　佐剂引起的炎症反应能增强T细胞反应的启动是一个悬而未决的问题。例如，一个炎症通路关键复合物，炎症体，是建议研究的。而不是要招募APC和增强T、B细胞反应伴随与铝盐佐剂的免疫反应。尽管在基因相同的小鼠上使用类似的方法。也不清楚是否PRR介导的途径必须由DCS自己激活，或局部组织细胞内的炎症反应可以解释一些佐剂作用。例如，炎症细胞因子可以招募单核细胞到注射部位后分化成树突状细胞。这些可能被激活后迁移到淋巴结，将抗原呈递给T细胞。这样的招募是MF59、水包油乳液和铝盐佐剂的一个行为。

　　细胞记忆的建立：尽管经过多年的研究，免疫学家仍然不知道这些信号是生成记忆性T细胞所必须的。这可能是一个随机过程，其中一个百分比的细胞是随机选择去生存，或有一个选择性的过程，在这个过程中，细胞在反应的早期被指定为生存和产生记忆细胞库。记忆细胞可以识别的特征标记，在测量不同的抗原佐剂组合的有效性方面可能是有用的。在某些情况下，记忆细胞的产生表达淋巴结的标记与长期生存有关，从而起保护作用。与之相反，其他研究者认为，记忆的细胞可能迁移到非淋巴器官，在这些地方重新感染有可能发生，提供*有效的保护。因此，保护能力的测量（例如，减少病毒滴度或细菌负荷后的挑战）比记忆细胞的表型是一个成功疫苗的更有用的指标。

　　许多变量可以影响记忆细胞的数量和表型。例如，大剂量的抗原可以激活大量的细胞，但疫苗更倾向于低剂量。如果它激活了高亲和力受体的细胞，这对一些感染可能是更有效的。在结核分枝杆菌感染的小鼠模型中这似乎是真实，低剂量引发诱导高度敏感的T细胞能产生一个广泛的细胞因子反应，这与保护有关。类似，通过在疫苗中添加佐剂可以改变其炎症程度。影响记忆细胞的表型和数量，部分原因是由于有效的扩张和T细胞的存活需要炎症信号。但是，通过减少在启动过程中的炎症反应，记忆细胞产生的速度可以增加，从而导致更快速的产生记忆细胞。它是关键的，因此，抗原和佐剂的量的调整取决于需要多少和什么类型的记忆细胞来提供保护。这使我们提出问题，CD4细胞和CD8两类主要T细胞在提供保护方面是多么重要。

　　CD4 T细胞介导的保护：很明显，CD4 + T细胞是细胞和体液免疫重要因素。它已被验证多年，CD4 + T细胞能辅助B细胞。但CD4 + T细胞对产生效应CD8记忆T细胞也是至关重要的。任何疫苗，无论其预期目的，必须激活辅助性CD4 + T细胞。也许*重要的考虑因素决定什么佐剂在疫苗中的应用，需要考虑直接随之而来的理想的免疫反应是什么类型的CD4 + T细胞的反应。现在公认CD4 + T至少有五种亚群：Th1和Th2细胞，以不同的方式激活巨噬细胞，和诱导B细胞产生不同类型的抗体。Th17细胞，导致炎症；T滤泡细胞，这是专门活化B细胞的。调节性T细胞，这被认为是预防自身免疫性疾病。这些亚群已在其他地方被广泛审查，在这里，我们将主要讨论与疫苗接种后保护相关的Th1细胞。虽然很明显，疫苗接种后CD4 + T细胞必须 被激活，但产生CD4记忆细胞的重要性还不是很明显。我们*近已经讨论过一些细节，所以在这里不会讨论细节问题。对现有的证据仔细分析表明，相对较少的保护性免疫反应依赖于CD4 + T细胞记忆。然而，结核分枝杆菌的保护是一个CD4记忆细胞如何行为的很好例子。CD4 + T细胞产生的细胞因子干扰素（IFNγ）激活巨噬细胞对结核杆菌感染的肺提供重要保护。目前的结核疫苗，卡介苗（BCG）为儿童提供保护，抵抗严重的疾病。但它成年人使用是有限的。因此，很多结核疫苗的研究都集中在一个主要的刺激方法，一系列的疫苗，与卡介菌素作为主要的疫苗和二次实验性疫苗，旨在重新激活和增加保护性的记忆反应。随着一些物质的刺激被试过。例如，一种改良型痘苗病毒（MVA）从结核分枝杆菌表达的蛋白， 85A，已在动物和人类上被测试过。用痘病毒载体，产生广泛的免疫反应，包括DCS产生的IL-12和CD4细胞分泌的IFNγ。在小鼠的研究模型中， MVA85A在动物模型中减少细菌水平。疫苗也能成功提升人类的抗原特异性细胞和随之而来的记忆细胞产生一系列的细胞因子，包括干扰素IFNγ和肿瘤坏死因子TNFα. 这种多功能的细胞，能产生更高的水平细胞因子，已被证明在小鼠模型中能提供保护作用，防止感染，包括肺结核。

　　CD8 T细胞介导的保护：虽然很难证明CD4记忆T细胞有直接保护作用， CD8 + T细胞分化为CTL一直是衡量其保护效果的手段。太淋巴器官活化和克隆扩增后，CTL淋巴细胞迁移到炎症部位，在那里他们杀死被感染的细胞通过诱导细胞凋亡，从而限制并*终清除感染。CTLS已被证明在各种小鼠感染模型中均能提供保护。在体外实验表明用人类的CD8 + T细胞能验证CTL活性。CTL也对人类感染流感后提供保护相关。流行性感冒病毒亚单位疫苗发展的重点转向产生记忆性CD8 + T细胞，可以提供更多的交叉反应性的保护。如上所述，这是因为CD8+ T细胞识别病毒少量.变异部分。已经开发了几种方法，*有趣的是那些疫苗目标部位时肺，在正确的位置产生记忆细胞以提供*快速的保护。例如， CD8 + T细胞识别肽能结合脂质部分，Pam-2-Cys，激活DCs 上的TLR受体成功保护CD8 + T细胞。当鼻内传送时，这种疫苗产生的CD8 + T细胞转移到肺部提供即时保护。肽片段而不是整个抗原的使用，因为不同的片段是由不同个体的T细胞识别，需要识别和包括一个非常大数量的不同片段。作为替代，整个去污剂灭活流感病毒可以结合免疫刺激复合物。它可以将抗原呈递给DCS和激活一系列天然免疫细胞，产生Th1细胞和CTL反应。免疫刺激复合物含有灭活流感病毒已被用来制成一个鼻内疫苗，包括所有的病毒蛋白和能诱导交叉反应性的保护。这种保护所需的CTL和抗体，表明免疫刺激复合物（ISCOM）疫苗能诱导有效的细胞免疫和体液反应。

　　通过CTLs细胞和Th1细胞杀死受感染的细胞是有效途径来清除细胞内感染的病原体。然而，在某些情况下，如肝脏感染乙肝病毒，干扰素IFNγ产生CD8+T细胞提供更有效的保护，因为没有大量的宿主细胞的死亡病毒可以被清除。同理，干扰素γ产生CD8+T细胞与RTS、疟疾疫苗接种者产生的保护是相关的。这种疫苗含有一种来自于寄生虫的蛋白质与乙型肝炎病毒的表面蛋白。虽然免疫个体抵抗感染的机制不是很清楚。据认为，在疟疾感染时，针对多种抗原在寄生虫的生命周期的不同阶段表达的体液免疫和细胞免疫是有必要的。作为*成功的疟疾疫苗的佐剂系统是AS02，制备在微粒系统中含有皂苷成分和TLR激动剂MPL。值得注意的是，在个体保护免疫过程中皂苷和MPL需要诱导适度水平。相比之下，使用相同的抗原用氢氧化铝佐剂和MPL佐剂(AS04)或水包油乳液（AS03）能诱导高水平的抗体，但不能防止感染。对保护机体对反应一个更深的理解可能有助于有效地识别更有效的抗原佐剂的组合。例如，成功的佐剂，AS02，促进免疫反应，Th1细胞分化和广泛的抗体反应。这表明，在防御复杂的病原体方面，抗体和细胞介导的免疫力均有重要的作用。

　　理想佐剂：免疫系统有多种多样的机制来处理传染性生物体。成功的疫苗应能激活免疫反应，创造一个冗余的保护性反应，可以应对病原体的突变和逃生策略。虽然活的减毒病毒和细菌疫苗可以激活所有免疫系统，佐剂目前为止没有达到这个目标。通过结合佐剂，如与MPL同铝盐，或使用DNA和细菌或病毒载体的刺激策略，如上面所讨论的已经报道，可以激活体液免疫和细胞介导的反应。黄热病和天花（牛痘）是非常有效的病毒活疫苗促进T、B记忆细胞和促进终身保护。