动物造模,混合性记忆障碍模型 中国实验动物信息网 2023-01-18 819

　　(一)反复脑缺血再灌法建立学习记忆障碍模型

　　1.造模材料  动物：昆明小鼠，雄性，25～28g；药物：水合氯醛；器械：恒温电热箱。

　　2.造模方法  水合氯醛麻醉后，下颈正中切口分离双侧颈总动脉，并用无损动脉夹夹闭动脉。缺血方式采用缺血15min，再灌15min，再缺血15min。并于*次缺血时鼠尾1cm处剪断放血造成低血压。假手术组不夹闭动脉，不放血。缺血过程中用恒温电热箱保持小鼠体温于(36.2±1.2)℃。术后4天起训练并测验水迷路成绩。

　　3.造模原理  采用小鼠反复脑缺血再灌引起学习记忆障碍建立模型。

　　4.造模后一般变化  水迷路实验小鼠游完全程时间，造模组小鼠为(168.3±75.1) min，明显长于假手术组(24.7±15.5)min；水迷路实验小鼠错误次数，造模组小鼠(17.9±11.1)次，明显多于假手术组(2.5±1.6)次。说明造模成功。

　　5.造模后生化变化  小鼠脑组织内乳酸水平，造模组小鼠为(28.06±0.79)mmol/g，假手术组为(24.40±2.02)mmol/g，有显著性差异。

　　6.注意事项  手术器械严格消毒，防止手术感染，手术创伤应尽可能小，严格无菌操作。饲养室内尽可能保持动物的*适温度、湿度。

　　(二)暂时性脑缺血法建立学习记忆障碍模型

　　1.造模材料  动物：昆明小鼠，雄性，18～22g；药物：麻醉剂。

　　2.造模方法  动物麻醉后，仰卧位固定。颈部正中剪开皮肤约7mm，分离双侧颈总动脉，于左侧动脉下置0号白丝线，右侧动脉下置0号黑丝线，供阻断血流用。各线两端并齐，将4终端通过一段长约5mm的PE50塑料管。由颈背部正中穿出皮肤，塑料管埋于皮肤内。用另一黑色丝线穿过黑白两线套住血管的环部，该线的两端由颈下部切口处引出皮肤，缝合切口。缺血时用一镊子轻按颈背部皮肤，拉紧黑白4根线终端，并以动脉夹将4根线与皮肤固定，造成大脑缺血状态。缺血结束，松开动脉夹，轻拉颈下引线，即可使颈总动脉完全恢复血液再灌注。

　　3.造模原理  采用小鼠暂时性脑缺血引起学习记忆障碍建立模型。

　　4.造模后的变化  双侧颈总动脉完全阻断后，首先出现惊厥，体温降低，呼吸减慢，*后翻正反射消失。在缺血过程中动物有可能死亡。恢复血液灌注后，动物翻正反射逐渐恢复，呼吸加快，3～5h基本恢复正常活动。假手术组动物体温无明显变化。

　　跳台实验显示，造模组动物与假手术组动物相比较，假手术组学习时错误次数为(1.77±0.73)次，记忆时错误次数为(0.55±0.93)次，学习时逃避潜伏期(escape latency, EL)为(23.8±31.1)s，记忆时跳台潜伏期(step-down latency, SDL)为(282.7±36.4)s；造模组学习时错误次数(3.00±2.16)次，记忆时错误次数为(1.58±1.16)次，潜伏期学习为(24.8±31.0)s，记忆为(140.4±120.3)s。学习成绩较差，表现为反应时间延长，错误次数增多。

　　避暗实验显示，造模组动物与假手术组动物相比较，假手术组学习时潜伏期为(157.0±34.3)s，记忆时潜伏期为(297.6±19.6)s，学习时错误次数为(2.27±1.62)次，记忆时错误次数为(0.27±0.65)次；造模组学习时潜伏期为(157.4±24.6)s，记忆时潜伏期为(187.8±72.4)s，学习时错误次数为(1.83±1.11)次，记忆时错误次数为(3.00±1.33)次。

　　5.注意事项  手术器械严格消毒，防止手术感染，手术创伤应尽可能小，严格无菌操作。饲养室内尽可能保持动物的*适温度、湿度。

　　(三)双侧颈总动脉永久结扎性大鼠记忆障碍模型

　　1.造模材料  动物：Wistar大鼠，雄性，280～300g；药物：戊巴比妥(40mg/kg)。

　　2.造模方法  动物麻醉后，仰卧位固定。颈部正中去毛消毒后切口，分离双侧颈总动脉并用丝线结扎，缝合切口。假手术组动物除不做双侧颈总动脉结扎外，其余处理与结扎组相同。两组动物同条件饲养。

　　3.造模原理  采用大鼠永久性脑缺血引起学习记忆障碍建立模型。

　　4.造模后的变化  动物结扎双侧颈总动脉后24h内的死亡率约为30％，48h后死亡率为0。结扎后，多数大鼠眼睑下垂，活动能力低下，自发活动减少，但也有少数大鼠术后自发运动增加。术后第2天所有存活的大鼠都恢复正常。存活30天时，可出现明显的学习记忆障碍；60天后，学习记忆能力仍然降低，且无恢复的趋势。

　　5.造模后生化及病理变化  术后90h，海马锥体细胞细胞质内尼氏体减少或缺陷，并出现凋亡小体。术后60天，海马锥体细胞密度明显减低。

　　6.注意事项  手术器械严格消毒，防止手术感染，手术创伤应尽可能小，严格无菌操作。饲养室内尽可能保持动物的*适温度、湿度。

　　(四)脑缺血再灌致小鼠学习记忆障碍模型

　　1.造模材料  动物：雄性KM小鼠，28～33g；药物：4％水合氯醛。

　　2.造模方法  实验小鼠术前12h禁食，自由饮水。4％水合氯醛(0.1ml/10g体重)腹腔注射麻醉后，仰卧固定于鼠解剖板，颈正中剃毛，以碘酒和75％酒精做皮肤常规消毒，沿前后方向正中线纵向剪开颈部皮肤约0.5cm，钝性分离组织和肌肉，暴露并分离出双侧颈总动脉，下穿丝线备用。注意不要损伤迷走神经。于锁骨上方剪一0.5cm切口，分离颈总静脉。颈总静脉处插管(预先肝素内浸泡)抽血降压(总血量的30％)。无创性微动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min。计时结束，松开动脉夹，并回输血液，拔出导管，缝合伤口。动物随机分组为：假手术组、模型组。假手术组的麻醉及手术过程与模型组相同，但不阻断血流、不放血，以减少手术损伤造成的误差。术后第15天进行自发活动和被动回避实验，第17天进行空间分辨学习记忆实验。

　　3.造模原理  脑组织对缺血、缺氧非常敏感。采用双侧颈总动脉夹闭合并取血降压再回输的方法建立小鼠学习记忆障碍模型。

　　4.造模后一般变化  与假手术组比较模型组小鼠自发活动明显减少，假手术组(149.2±34.6)次，模型组(102.4±31.2)次；模型组在跳台学习记忆测试中成绩明显差于假手术组的成绩，表现为训练中上台潜伏期[假手术组(6.45±6.35)s，模型组(13.09±9.45)s]、受电击时间[假手术组(15.55±10.27)s，模型组(25.91±11.16)s]明显上升；记忆成绩中的错误次数[假手术组(1.36±1.21)次，模型组(3.91±2.43)次]明显增多，下台潜伏期[假手术组(217.1±65.6)s，模型组(18.3±21.0)s]、台上总停留时间[假手术组(239.5±45.7)s，模型组(63.27±63.89)s]显著下降。

　　与假手术组比较，模型组小鼠空间分辨学习记忆成绩明显降低，训练第3天模型组寻台潜伏期.[假手术组(22.00±11.26)s，模型组(83.91±63.02)s]显著上升，训练第4天寻台潜伏期[假手术组(14.91±5.47)s，模型组(37.91±37.38)s]，训练第5天寻台潜伏期[假手术组(12.91±1.58)s，模型组(24.73±17.32)s]模型组与假手术组有显著差异。模型组错误次数明显增多[训练第3天假手术组(3.82±1.89)次，模型组(8.91±6.09)次；训练第4天假手术组(2.55±1.13)次，模型组(4.27±2.45)次；训练第5天假手术组(3.36±0.67)次，模型组(3.64±1.57)次]。

　　5.造模后生化及病理变化  苏木素伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色后，光镜下观察可见假手术组小鼠海马神经元数目多，呈多层，排列整齐紧密。细胞核大而清晰，核仁明显。模型组海马CAI神经元数目有所减少，脱失现象明显，层次少而不清，核固缩为三角形或多角形，浓染。

　　与假手术组比较，模型组小鼠脑组织匀浆总抗氧化能力[假手术组(0.48±0.04) U/mg·prot，模型组(0.24±0.04)U/mg·prot]、总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性明显下降[假手术组(123.5±14.5)U/mg·prot，模型组(66.9±13.9)U/mg·prot]，模型组小鼠脑组织匀浆中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量比假手术组明显上升[假手术组(0.59±0.15)nmol/mg·prot，模型组(1.17±0.24) nmoL/mg·prot]，说明缺血再灌引起了脂质过氧化损伤。

　　6.注意事项  在全部造模过程中观察动物体温，保持动物肛温在(36±0.5)℃左右，以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。

　　(五)低铁饲料、缺锌与高锌饲料导致学习记忆障碍模型

　　1.造模材料  动物：健康大鼠；药物：低铁饲料(含铁量为11.9mg/kg)，去离子水，缺锌(＜2mg/kg)与高锌(1000mg/kg)饲料。

　　2.造模方法  以低铁饲料(含铁量为11.9mg/kg)，去离子水饲养大鼠10周。或缺锌(＜2mg/kg)或高锌饲料(1000mg/kg)，去离子水饲养大鼠4周。

　　3.造模原理  铁、锌的缺乏以及锌铝的过多均可导致学习记忆障碍。

　　4.造模后一般变化  低铁饲料饲养10周后测试，显示出现记忆障碍。缺锌与高锌饲料分别饲养4周后测试，均显示出现记忆障碍。

　　5.造模后生化及病理变化  低铁饲料饲养大鼠脑组织铁含量及单胺氧化酶活性显著降低，大脑皮层去甲肾上腺素及5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)含量增高，CA3区神经胶质细胞足突肿胀，细胞器稀疏。缺锌饲料饲养组血清和脑锌、铁含量降低，铜增高；高锌组则血清锌明显增高，血清和脑铜、铁含量均明显降低，两组脑组织5-HT明显降低，5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid, 5-HIAA)则明显增高。