动物实验 中国实验动物信息网 2021-02-21 1027

　　简介：益生菌的使用日益增加，使我们对肠道微生物组分和细菌代谢物通过不同的调节途径对神经和行为过程的相关影响的知识有所拓宽。大多数研究都集中在人类或其他哺乳动物身上。然而，近年来，鱼类模型物种的使用越来越普遍，这是因为它们很容易被人工圈养，而且它们的某些神经通路与哺乳动物的神经通路是同源的。斑马鱼是一种模式物种，其益生菌实验的结果可以用作人类治疗的参考，因为它们具有相似的肠道微生物群和定殖模式。新的水箱测试（NTT）是*广泛使用的实验程序之一，旨在测试斑马鱼的焦虑相关行为。它是基于它们自然的偏好，即首次将其放置在新型水箱中时会在底部附近游泳。 鱼离开水箱底部并开始探索其他区域之前所花费的时间差异通常被认为反映了他们所经历的焦虑。多项研究使用此方法分析了不同物质对鱼类性能的影响，观察到与抗焦虑药呈正相关。 但是，尚未深入研究益生菌摄入对行为反应的附带影响，在某些情况下对压力的反应有所降低，而在其他情况下则无直接相关性。因此，触发这种反应的机制仍不清楚。在本研究中，分析了鼠李糖乳杆菌CECT8361和长双歧杆菌CECT7347菌株的益生菌混合物（1:1）对斑马鱼探索行为的影响，已经证明了这两种益生菌在改善人类和斑马鱼生精性能方面的作用。

　　这项研究使用了两组，分别为九条成年（8月龄）野生斑马鱼（AB品系）。将所有鱼饲养在3升的水箱中，并从配备有机械，化学和生物过滤器的再循环系统中交换水。 将水温保持在26°C， 光照14/10明暗循环。为了评估益生菌给药对鱼类行为的影响，对各组进行了为期4个月的不同投喂方式。对照组每日两次喂食商业斑马鱼饲料，实验组，除商业饲料外，还每日提供109 CFU的鼠李糖乳杆菌CECT8361和长双歧杆菌CECT7347。行为测试前一个月，将每只鱼在110 mg / L的三卡因甲磺酸缓冲液中麻醉，并分别用可见的植入弹性体进行标记。

　　新型水箱试验：将四边形玻璃水族箱（20×8×18 cm；长×宽×深）填充至总体积为3.5 L，并将其用作评估场所。使用网将每条鱼分别放置在水箱底部，并记录其游泳行为，持续6分钟。试验结束后，鱼被转移到一个回收箱里。使用NoldusEthovision®跟踪软件对视频文件进行了分析，生成了一个虚拟网格，将水箱分为上下两个区域。测定每个区域所花费的时间（以总时间的百分比表示）、区域间的交叉次数、平均速度、移动的总距离和以及*次穿越到上方区域的等待时间。

　　结果：将鱼放置在新的环境中时，其本能会在水箱底部引发保护性潜水行为，从而降低被靠近水面的潜在捕食者攻击的风险。新型水箱试验（NTT）是斑马鱼行为实验中基于这种反应的一种常用试验。由于NTT在“安全”潜水行为和“探索”游泳行为之间存在冲突，因此可以研究在特定实验条件下鱼的趋地逃逸潜水本能的强度。在正常受控的实验室条件下，通常在监视的前几分钟，鱼通常会在水箱底部花费更多的时间，表现出更高的不稳定运动和静止事件。适应期过后，动物逐渐探索水箱的上部。结果表明，成年斑马鱼喂食抗氧化剂和抗炎益生菌四个月后，与对照组相比，其行为模式发生了强烈改变。利用Ethovision软件建立了两个同质的虚拟分区，以分析探索模式。结果显示，在新的水箱试验中，对游泳区域（上下）的偏好有统计学上的显著差异。分析热图时，益生菌喂养的动物对上部区域表现出强烈的偏好。另一方面，标准喂养的动物并没有表现出对上部区域的这种偏爱。在对照组中，只有50%的受试鱼表现出对上部区域的偏好，而88.89%的益生菌喂养动物更喜欢靠近水面。实际上，在6分钟新型水箱试验中，益生菌组的9条鱼中有7条在上部区域花费了80％的时间。还评估了速度，每只动物的总游走距离，各区域之间的穿梭次数以及到*次穿越到上部区域的潜伏期。 统计分析仅记录了平均速度的显著差异。在我们的实验中，与益生菌喂养的鱼类相比，CTRL显示出更高的速度。益生菌组进入上部区域的潜伏期非常短（对上部区域进行探索之前，没有一条鱼持续超过10秒）。这些数据令人关注，因为它们结合了明确的空间偏好； 它们表明群体之间的行为模式存在明显差异。 应激可以调节斑马鱼的NTT模式行为。一些通常用于治疗人类焦虑症的抗焦虑药物往往会增加斑马鱼在实验装置顶部停留的时间。结果的相似性表明，益生菌混合物可能会对模型动物的焦虑调节产生影响。

　　摄入鼠李糖乳杆菌CECT8361和长双歧杆菌CECT73474个月后可调节斑马鱼的行为。 （A）实验设计的示意图。（B） 新型水箱试验（NTT）示意图和确定的分析区域。（C）对两个实验组（对照组和益生菌组）的轨迹进行Ethovision分析后获得的热图。（D） 动物在上部区域所花费的时间（%）；（E）平均速度（cm/s）；（F）总距离（cm）；（G）穿梭次数（n.）（H）穿越到上部区域的延迟。

　　总之，确定鼠李糖乳杆菌CECT8361和长双歧杆菌CECT7347的长期摄入（4个月）会改变斑马鱼模型的游泳方式。结果表明，喂食成年斑马鱼抗氧化剂和抗炎益生菌混合物后，可以大大减少斑马鱼在新水箱的趋底行为。这种主要的行为反应与较低的焦虑状态相关。 因此，可以认为摄入这种益生菌混合物是治疗焦虑症的有益方法。