动物造模,兔先天性横膈疝气管阻塞模型 中国实验动物信息网 2021-01-15 613

　　方法：先天性横膈疝（CDH）是一种出生缺陷，每2000-4000个活产就发生一次。正常横膈膜发育失败导致横膈膜缺损，使腹内内容物疝入胸腔。CDH导致肺发育不良和肺动脉高压，导致该人群的发病率和20%的死亡率。尽管医学上的进步是对出生后的CDH婴儿管用，但死亡率仍然不变。因此，有必要对胎儿进行治疗，以刺激CDH胎儿的肺部生长，减少肺部发育不全，从而降低呼吸系统受损的风险。胎儿气管阻塞（TO）的概念来自于观察到患有喉闭锁的胎儿出生时肺部增生。在20世纪90年代早期，TO首次在CDH的背景下应用于lamb CDH模型中，在该模型中，我们注意到肺的显著生长和肺发育不全的逆转。目前，有三种类型的CDH动物模型存在-遗传，药理学和外科。CDH的遗传模型主要存在于具有敲除基因的啮齿动物模型中。这种模式可能*不受欢迎，因为人类的大多数CDH病例与遗传缺陷无关。因此，CDH的遗传模型*不适用于人类条件。药理学模型包括在怀孕啮齿动物中使用一种叫做硝基芬的致畸除草剂，这种除草剂会导致其后代的CDH和肺发育不良。这种模式是 Iritani在20世纪80年代首次探索的。通常情况下，100毫克硝酸芬溶解在1毫升橄榄油中，在妊娠第9天给予，以诱导啮齿类动物的CDH。给药硝芬可导致70-80%的胎儿出现右侧或左侧膈肌缺损，100%的胎儿出现肺发育不良。硝基芬诱导的CDH啮齿类动物模型的优点包括成本低、使用方便。然而，尽管硝基芬在肺发育的早期阶段诱导了一种类似于人类的膈肌缺损，但由于人类中还没有已知的致畸相关CDH，因此使用致畸剂诱导这种缺损是值得关注的。CDH的手术模式有助于探索CDH的治疗方法和创新疗法。这种模型主要用于绵羊和兔子。20世纪60年代，Delorimier 利用胎儿羊羔建立了*个CDH手术模型。横膈膜缺损是在妊娠72-75天时通过外科手术造成的，这与肺发育的小管期相对应，妊娠期为145-149天。20世纪90年代初，Fauza等人在胎兔身上建立了CDH手术模型。使用兔子而不是绵羊有许多优点：成本较低，妊娠期较短，32天，肺部生理学与人类相似。在兔模型中，横膈膜缺损是在妊娠23天产生的，也在肺发育的假腺期。与其他模型相比，肺生理学与人类更为相似，因为在兔子体内，肺泡化开始于出生前，并在出生后完成，而在绵羊体内，肺泡化几乎在出生时完成，在啮齿动物体内，肺泡化开始于出生后。利用家兔作为手术模型的可行性以及它们相似的肺生理学，使其成为*理想和*有希望用于CDH研究的动物模型。

　　围手术期护理：新西兰大白兔怀孕时间为13天时，每个月，一组5只进入设施，单笼饲养，自由饮食和饮水。每只动物都进行两次手术，一次在妊娠23天时产生CDH，第二次手术，在妊娠28天进行TO手术。术前，每只孕兔接受0.12 mg/kg丁丙诺啡SR SQ（3 mg/ml）止痛，青霉素G 3000000 IU  肌肉注射预防感染，Depo provera 4.5 mg 肌注减少自然流产风险。用5 mg/kg的氯胺酮（100 mg/ml）、0.15 mg/kg的右旋美托咪定（1 mg/ml）、0.01 mg/kg的甘菊酯SQ（0.2 mg/ml）诱导麻醉，并通过面罩使用5%异氟烷维持麻醉。手术过程中使用氯化钠补液，并在眼部涂抹眼胶，手术过程中使用水循环垫维持正常体温。固定四肢。监测生命体征并将其维持在正常范围内，包括心率180–250、呼吸频率30–60和温度38–40℃。手术后对其体重、摄入/排出及手术切口进行密切监测。每24小时给予美洛昔康0.2 mg/kg SQ（5 mg/ml）连续2天，用于术后镇痛。

　　创建CDH：共有75例胎儿在妊娠23天时产生CDH。如上文所述，孕兔预先给药的。剪除腹部皮毛，用2%氯己定制备腹部并覆盖，在下中线剖腹，暴露子宫。计算每个子宫角的胎儿数。从每个子宫角的*卵巢端选择两个胎儿，每个子宫角共有4个胎儿。轻轻触诊确定胎儿位置。用15#刀在子宫反中膜侧进行1 cm子宫切开术。使用6-0 Prolene@缝合钱缝合。对胎儿的左上肢进行了识别、暴露和头侧回缩。在胸侧血管之间的标志处，用25号针和止血钳进行了左侧胸廓切开术。肺部收缩，露出胎儿横膈膜。用止血钳抓住横膈膜，用细剪刀剪开一块，造成横膈膜缺损。胸壁用6-0 Prolene@缝合。胎儿被重新放回到子宫内，并将子宫切口缝合。剖腹手术切口采用3-0 Vicryl?缝合。在*后一组5个孕兔中，产生了10个假CDH胎儿。如前所述遵循手术方案。在产生CDH后，在卵巢*末端再选择两个胎儿。假CDH是通过在不产生横膈膜缺损的情况下进行左侧胸廓切开术而产生的。我们建议每只孕兔*多接受4个胎儿手术，以提高胎儿的存活率。我们发现，增加假胎和将手术胎数增加到6只会增加孕兔和胎儿的手术时间和手术压力，并导致更高的死亡率。

　　气管阻塞：共有17例胎儿在妊娠28天时进行了TO。如上文所述，孕兔是预先给药的。被诱导麻醉，腹部被消毒制备好并以无菌的方式覆盖。打开下剖腹切口，计算胎儿数量。观察到生存能力。半数可能存活的CDH胎儿被选为TO。做子宫切开术，露出胎头。立即用浸过盐水的无纺布海绵覆盖口鼻，以确保没有胎儿呼吸。在甲状腺上缘作水平切口。直接切开气管。分离后，气管用4-0 Vicryl@缝合线双重结扎。胎儿皮肤用6-0 Prolene@缝合。子宫是用6-0 Prolene@连续缝合。孕兔的筋膜用3-0 Vicryl@缝合，皮肤用4-0 Monoryl@缝合。术后治疗如上所述。

　　安乐死和器官恢复：孕31天时进行胎儿体重和肺组织收集。每只孕兔用10-50 mg/kg氯胺酮（100 mg/ml）和2.5-10 mg/kg甲苯嗪（100 mg/ml）镇静，并通过耳静脉给予100 mg/kg戊巴比妥钠IV（50 mg/ml）安乐死。进行了中线剖腹手术，并对孕兔的心脏进行了触诊，以确认没有心脏活动。所有胎儿均已取出。立即用浸过盐水的无纺布海绵覆盖口鼻，并将每个胎儿处死，以确保没有胎儿呼吸。所有胎儿称重。进行胸骨切开和中线剖腹手术，评估横膈膜是否存在横膈膜缺损。同时在胎儿的CDH+处切开颈部，评估气管是否存在结扎。从每只含有其他手术标本的母兔中选择一个对照未手术胎儿，并根据其重量（即产仔数的平均值）进行选择。测量每个胎儿的总肺重量和右肺重量，用减法计算左肺重量。收集上肺叶并储存在4%多聚甲醛中，下肺叶冷冻在液氮中并储存在-80°C中。

　　方法验证：这种创造CDH的手术技术导致肺发育不全，并被气管阻塞所逆转。*近，我们对家兔CDH模型气管阻塞对Wnt信号转导的影响的研究证实了这一点。