支气管哮喘动物模型 中国实验动物信息网 2021-01-12 461

　　背景：葡萄由于其独特的化学组成和营养价值高被广泛用作天然膳食补充剂。水果是多酚，花青素，黄烷醇，芪（白藜芦醇）、酚酸、蛋白质、脂肪、维生素（C、A）、矿物质（钙、硼、磷等），水，碳水化合物和纤维的一种很好的来源。植物的药用价值早已被民间医学所认可。关于慢性气道疾病如哮喘和慢性阻塞性肺疾病的炎症过程，疾病病理直接与肺中活性氧生成量增加有关。一些临床研究表明，补充抗氧化剂对轻度至中度哮喘的成年人有益。因此，氧化损伤在支气管哮喘的发病中起着重要作用，因此可能是哮喘治疗的潜在靶点。哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，其特征是气管支气管树可逆性收缩，对各种刺激气道高反应性如环境过敏原、呼吸道感染、冷空气、运动和某些药物。在人类中，过敏性哮喘主要是由I型过敏反应引起的，这种反应反映出对外源性过敏原产生免疫球蛋白E（IgE）的敏感性增加，其分泌和分化依赖于CD4 +辅助性T细胞（Th2型）。活化的Th2细胞产生的细胞因子如白细胞介素（IL）- 3、IL-4、IL-5、IL-13反过来在B细胞促进IgE细胞生产，肥大细胞生长（IL-4）和嗜酸性粒细胞IL-5生存等方面发挥作用。IL-4和IL-13刺激上皮细胞产生转化生长因子（TGF-βα）导致粘膜上皮化生和成纤维细胞的增殖。促炎介质包括肿瘤坏死因子（TNF）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），刺激内皮细胞上的血管粘附分子的表达，导致炎性白细胞进入支气管树。本研究进行干果制品葡萄对卵清蛋白诱导的过敏性哮喘大鼠模型的治疗潜力评估。

　　方法：动物：雄性Wistar大鼠（180–220克；8–10周龄），动物在受控条件下饲养（室温25～2°C，湿度45－5%，光照12小时：暗循环）。所有动物都可自由采食和饮水。

　　实验设计：雄性wistar大鼠，随机分为5组（每组6只）。组1，非致敏对照，接受赋形剂(0.4 mL/kg);组2，卵清蛋白（OVA）致敏或哮喘对照，仅接受赋形剂；组3，（OVA +地塞米松），参考标准是OVA致敏给予地塞米松（2.5毫克/公斤体重）；组4和组5，实验组（OVA + vvhe 1和OVA + vvhe 2）在OVA致敏并获得葡萄乙醇提取物（vvhe）（31和42.5毫克/公斤/体重）。葡萄果实在印度阿育吠陀药典中提到的一个重要组成部分（API）。每天早晨口服药物或赋形剂，连续28日。所有动物（除组1）在第1天腹腔注射过敏原悬液（卵清蛋白，40毫克/鼠+氢氧化铝，2毫克/鼠）致敏。经过15天的敏化，动物暴露于含1%的卵白蛋白的生理盐水中20分钟。非致敏组动物在相同的环境下暴露在生理盐水中。雾化吸入溶液在密闭室（尺寸40×32×32厘米）每日一次，连续8天，即从15天到22天，随后 25天和28天吸入。

　　肺功能和支气管收缩试验：第28天，暴露OVA后，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉（105毫克/公斤）。用了12G套管（2毫米直径）进行气管插管。插管连接一个呼吸速度记录仪和压差传感器测量呼吸频率（f，次/ min）。通过气流信号的电子积分获得肺潮气量（VT，ml）。股静脉插管记录（1）赋形剂使用前后，2）乙酰甲胆碱治疗前、后，10 - 12个呼吸周期平均出一个数据点，F和VT的变化。维库溴胺（0.2 mg/kg）静脉注射，避免发生自发性呼吸。用小聚乙烯管排出过多的支气管分泌物，不干扰气管。

　　支气管肺泡灌洗液（BAL）收集：肺功能参数的测量后，用5毫升0.9%无菌生理盐水溶液（5毫升×3）通过空心导管对肺灌洗3次。从每只鼠收集的BAL液合并后离心（1500转，4°C，10分钟）。分离上清液和存储在−80°C直到分析IgE和细胞因子，将细胞颗粒重新悬浮在1毫升生理盐水中，用Jung等人描述的方法测定细胞总数和白细胞计数。

　　血清制备和细胞计数：收集BAL液后，用两个不同部位的心脏穿刺采集血液。*部分（2.5–3毫升）收集是在非肝素抗凝管；离心（3000转，10分钟）和血清存储在−80°C，评估IgE和细胞因子。（0.5毫升）是肝素抗凝管采集并存储在4°C直到测定细胞总数和分类计数。在肝素化血液采集后30分钟内，自动分析血液中白细胞和分类计数。细胞计数和涂片用Leishman染色（1.5%甲醇6分钟）。

　　IgE，LTD4、细胞因子、一氧化氮、血清和BAL液中亚硝酸盐的含量：采用酶联免疫吸附法（ELISA）试剂测定血清（500μL）和支气管肺泡灌洗液（5毫升）IgE，LTD4和细胞因子（TNF，IL-4，IL-5和IL-1β）水平。在自动elisa板阅读器上对样品进行分析。用一氧化氮量热仪测定血清和BAL液中总NO和亚硝酸盐的浓度。

　　肺灌洗液组胺分析：收集BAL液后，分别解剖每个动物的肺组织叶。其中一个肺叶用2.5毫升生理盐水均质化，根据Shore等人描述的方法用650 nm分光光度计分析组胺。

　　组织学检查：解剖肺组织用生理盐水冲洗，4℃固定于10%℃中性甲醛溶液24小时。石蜡包埋，切片。HE染色后观察。

　　结果：vvhe对肺功能参数影响：OVA致敏组相比非致敏组，注射乙酰甲胆碱后，呼吸速率显著增加。相比于OVA致敏对照组，接收接收vvhe 1（31毫克/公斤）或vvhe 2（42.5毫克/千克）动物呼吸速率分别下降13或21%。与对照组相比，OVA致敏动物的潮气量显著减少。与OVA致敏对照组相比，vvhe 2治疗哮喘大鼠（42.5毫克/公斤/体重）潮气量明显增加11%.地塞米松对照组的呼吸速率和潮气量分别提高37和28%，差异有显著性.

　　vvhe对循环血液中的细胞计数的影响: 对照组大鼠血液中循环白细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞总数明显高于非敏对照组. 相比之下，致敏大鼠血液中淋巴细胞数量较正常组少。与哮喘对照组比较, 地塞米松与vvhe 2治疗后嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数升高明显降低.. 两种药物治疗也使动物血液中淋巴细胞计数正常化.

　　vvhe对BAL液中炎症细胞数的影响: OVA致敏对照组与无敏对照组相比，BAL液组细胞总数及细胞计数明显增加（p＜0.001）。相比于致敏对照组，地塞米松和VVHE实验组的嗜酸性粒细胞，淋巴细胞，巨噬细胞和中性粒细胞显著减少。低剂量的VVHE也能减少灌洗液中的炎症细胞数目，对只对淋巴细胞核巨噬细胞有统计学意义。

　　vvhe对血清中LTD4和细胞因子水平的影响：相比于非致敏组，OVA致敏对照组能显著升高血清LTD4和所有细胞因子IL-4，IL-5、TNF和IL-1β水平。相比OVA致敏组，vvhe 1（31毫克/公斤体重）和vvhe 2（42.5毫克/公斤，体重）降低血清IL-4水平分别为17和24.2%，IL-5 水平17.1和28.2%、TNF水平 17和30.2%，IL-1β水平5 和15.3%，LTD4水平4.3和11%。地塞米松治疗OVA致敏动物血清LTD4水平明显下降44.7%，IL-4 、56.6%，IL-5、47.6%，TNF、53.3%和IL-1β、57.11%。

　　vvhe对血清和支气管肺泡灌洗液中IgE水平影响：大鼠血清和BAL液中IgE的致敏和激发比非致敏对照组显著升高。相比OVA致敏对照组动物，动物接收vvhe 1或vvhe 2表现出血清中的IgE水平大幅减少 17%或31%, BAL液中IgE水平减少14%或26%。与OVA致敏对照组相比，地塞米松治疗组的血清IgE水平降低了47.8%，而BAL液中的IgE水平降低了58%。

　　vvhe对总一氧化氮和亚硝酸盐含量的影响：与非致敏对照组相比，OVA致敏动物的总NO和亚硝酸盐水平显著升高。与哮喘组动物相比，血清一氧化氮和亚硝酸盐水平分别降低29.7%和31.4%。BAL液分别降低15%和27%。

　　Vvhe对肺组织中组胺水平的影响：OVA对照组大鼠肺组织匀浆中组胺含量显著高于非致敏对照组。与OVA致敏对照组相比， Vvhe1和Vvhe2分别降低25和41.6%组胺水平升高。而地塞米松治疗组肺组织匀浆组胺水平降低66.6%。

　　对肺组织病理学的影响： OVA对照组肺组织病理学检查显示细支气管管腔减少，炎性细胞浸润支气管周围组织和上皮脱落。Vvhe和地塞米松诱导的保护改善管腔大小的和明显减少细胞浸润。

　　结论：研究结果显示vvhe可能对支气管哮喘的治疗发挥了重要作用，表现在（1）通过抑制组胺释放、细胞因子产生对抗哮喘持续的炎症过程。（2）通过拮抗过敏原引起的支气管高反应性来改善肺功能；（3）阻止炎症细胞浸润（嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞）进入气道。建议开展进一步研究证实它是一种有价值的抗哮喘药物。