动物造模,兔单眼局限性感光细胞变性模型 中国实验动物信息网 2021-01-08 1116

　　背景：色素性视网膜炎是一种视网膜退行性疾病，可引起夜间失明，并*终导致周围和中央视力丧失。已经鉴定出几种负责RP的基因，其中大多数与光传输途径有关。这些发现尚未导致发现有效的治疗或预防策略。视网膜假体已被研究为刺激这些患者剩余的视网膜神经元引起幻觉和恢复视力的潜在工具。已经开发了啮齿动物光敏性的各种动物模型以研究视觉功能。CS大鼠在Mertk基因中自发发生突变，导致感光细胞变性。连续光照射是用于研究光变性机理的另一种技术。光敏兔子模型承担着复杂的行为任务，并且更紧密地模拟了人类的视觉功能。我们报告了两种生成单眼光感受力变性兔模型的方法。 Berteporfin是一种光敏染料，临床上没有副作用。在临床前研究中，维替泊芬和/或长时间暴露引起光感受器和视网膜色素上皮细胞的损害。贝特泊芬用于诱导局部视网膜感光细胞变性。硝普钠（SNP）用于治疗高血压。 SNP分解，在血液中释放一氧化氮（NO），并起血管扩张剂的作用。在视网膜中，过量的NO会诱导感光细胞变性。硝普钠的玻璃体腔注射引起广泛的光变性。二维teporphin和SNP诱导的感光细胞变性对对侧眼没有明显影响。光变性单眼模型的好处包括使用相同的动物眼作为对照。这减少了使用的实验动物的数量。

　　方法：按照说明使用Berteporfin。在我们的研究中，我们使用卤素反射灯作为光源。将2 mg维替泊芬溶于7 ml无菌蒸馏水中，并用5％葡萄糖溶液将浓度调节至0.1 mg/ml。溶液以1 ml/min的速度静脉内注射0.5 mg/kg。将SNP溶解在生理盐水中，并且将不同浓度的SNP注射到兔眼的玻璃体腔中。使用了18只荷兰荷兰兔。通过肌内注射氯胺酮（66 mg/ml）和甲苯噻嗪（33 mg/kg）麻醉兔子。用Verteporfin诱导视网膜变性并用1％的Atropin和2.5％的phenylefrin盐酸盐扩张瞳孔后，将视网膜暴露于距角膜10 mm的卤素反射灯下。在第二种模型中，使用外科显微镜将盐酸奥贝西汀局部施用于眼睛，切开一个小切口以暴露管，结膜和30号针，并将100μLSNP溶液施用于玻璃体。注入。两周后，使用便携式眼底照相机拍摄了眼底照片。治疗一个月后获得ERG记录。兔子在黑暗中过夜适应，并用1％的阿托品，2.5％的苯基effrin盐酸盐和0.5％的普罗帕金盐酸盐进行角膜麻醉。在角质层上放置一个带有金线环的小型隐形眼镜，在皮肤下的两眼之间放置一个银线参比电极。白色LED脉冲被激活以产生闪光，并且光刺激持续10毫秒。记录全视野暗视ERG，0.3-500 Hz带通滤波器，并为每种光强度平均5次响应。接地电极固定在尾部。白光LED（7500开尔文）用于白光刺激。如前Tomita等人所述，对用Verteporfin和SNP处理的眼睛的视网膜形态进行了分析。通过静脉注射戊巴比妥钠处死动物。除去眼球，固定，包埋在石蜡中，切出3微米厚的视网膜，并用苏木精-曙红染色。使用GraphPad Prism软件进行统计分析，统计显着性标准为P\u003c0.05、

　　结果：未经治疗的和未暴露的Berteporfin组无显着变化。暴露后，Verteporfin治疗组或玻璃体内注射硝普钠可引起视网膜萎缩。萎缩程度取决于暴露时间或SNP浓度。 Berteporfin治疗当视网膜仅暴露10分钟时，可以清楚地观察到视网膜色素上皮细胞（RPE）的色素沉着。在较长时间的光照下，色素沉着明显被标记为RPE萎缩。 Berteporfin和暴露明显限制了暴露区域。但是，SNP可引起周围性视网膜变性。荧光素血管造影显示视神经周围有出血，观察到1 mmol SNP。韦替泊芬治疗的眼中ERG振幅（波a和b）略低于未治疗的眼。随着曝光时间的持续，b波的振幅减小。在经过SNP处理的眼睛中，幅度随SNP浓度的增加而减小。即使仅注入0.1 mM SNP，ERG的b波幅度也会显着降低。没有光照射的维替泊芬治疗不会引起感光细胞变性。但是，视网膜（主要是感光细胞）的神经变性需要至少10分钟的暴露时间。在SNP引起的变性模型中，病变包括周围的内部视网膜和感光层。

　　讨论：光敏剂verteporfin被广泛用作光动力疗法（PDT）的一部分，用于治疗CNV。但是，PDT并不是脉络膜的纯净选择，它会损害视网膜。 PDT对感光细胞和视网膜色素上皮细胞诱导剂量依赖性损伤。某些波长的吸收会产生氧自由基。对感光细胞和视网膜色素上皮细胞有毒。资助照片显示，静脉注射韦替泊芬后，由于暴露于光引起的光感受器损伤仅限于照射区域。 SNP通过光化学反应释放一氧化氮，并以多种方式还原代谢产物，例如硫醇和微粒体生物细胞。O参与各种视网膜功能。本征型NO会增强光适应过程中的锥体反应，从而引起视网膜毒性和缺血性损伤。在正常情况下，局部缺血或持续暴露于强光下，视网膜变性的严重程度取决于局部NO水平。

　　结论：我们的结果突出了两种诱导兔色素性视网膜炎的方法：通过光和SNP。在Berteporfin曝光模式下，感光体变性会限制曝光区域。该模型有助于诱发局部光敏性病变，例如与年龄有关的黄体变性。相反，SNP诱导整个视网膜的感光细胞变性。这两个模型可能对再生研究（例如iPS移植开发和视网膜假体的基因治疗）有用。