兔角膜膨隆模型 中国实验动物信息网 2020-12-26 715

　　背景：圆锥形角膜（KC）是一种非炎症性、渐进性的膨隆性疾病，它通常是双侧的，其特征是角膜变薄、瘢痕形成、根尖突出和不规则角膜地形图。KC是世界上常见的一种临床疾病，其发病率约为每2000例出1例，无性别或种族倾向。这种疾病通常是从青少年时期开始的，而且通常进展到中年。KC通常导致近视和散光引起的渐进性视力损害。它是发达国家角膜移植*常见的病症。因此，KC已成为眼科广泛的临床和基础研究的焦点。KC确切的病因仍然是未知的，它可能涉及遗传和环境因素。KC的治疗方法包括隐形眼镜、硬性透气性透镜、角膜胶原交联、环内环段插入和角膜移植。了解疾病发生和发展的过程有助于检测KC的病因和治疗方法。作为基础研究的一个有价值的和不可缺少的工具，体内动物模型可以使研究者更好地了解KC的病理生理学，并验证发病机制的假说，以及评估潜在的治疗方法。然而，没有合适的KC动物模型是可用的，这可能是由于其复杂的和未知的病因。因此，需要一种能够重现这种疾病的病理生理特征的动物模型。KC是*常见的角膜膨隆障碍，因此建立角膜膨隆模型来模拟KC是很重要的。角膜屈光手术去除角膜组织破坏角膜生物力学，降低胶原拉伸强度。准分子激光原位角膜磨镶术（LASIK）在动物角膜，尤其是兔角膜上的应用是*常见的角膜扩张动物模型。然而，LASIK后扩张和KC在组织病理学和超微结构上可能不同，因此LASIK后扩张模型不是理想的圆锥角膜动物模型。降解酶如酸性酯酶、酸性磷酸酶和组织蛋白酶B和G之间的不平衡，以及它们的抑制剂如角膜抑制剂和巨球蛋白被认为与KC有关。研究表明，在这种疾病期间，基质中胶原含量降低。胶原酶活性在器官培养的KC角膜中增加，这导致局部胶原酶应用可用于产生角膜膨隆模型的可能性。Hong等人报道了外用胶原酶后角膜供体角膜曲率显著增加。在一项初步研究中，我们还观察到胶原酶处理的兔死后角膜的角膜曲率增加。然而，胶原酶处理的供体角膜的供应是有限的。因此，在下面的研究中，我们研究了使用II型胶原酶诱导兔角膜膨隆模型。

　　方法：动物和II型胶原酶制备：10只雌性新西兰大白兔，体重3～3.5 kg。自由采食和饮水。在整个研究过程中提供连续的临床护理（每天24小时/每周7天），以确保在需要时及时干预。用5%戊巴比妥钠0.6 mL/kg静脉注射动物，在手术中使用0.4%盐酸奥布卡因滴眼液进行表面麻醉，术前和术后进行眼科检查。II型胶原酶以粉末的形式溶于15%葡聚糖平衡盐溶液，*终浓度为5 mg/mL。

　　手术：10只兔二十只眼睛，随机分为两组。右眼为实验组，左眼为对照组。用0.6 mL/kg 5%戊巴比妥钠静脉麻醉兔。采用0.4%盐酸奥布卡因滴眼液进行表面麻醉。上皮清创术后，角膜环钻被放置在角膜上。实验组将200μl 的5μg/ml的II型胶原酶溶液转入角膜环，室温下，浸泡30min。然后用棉花拭子洗去溶液，用0.9%氯化钠溶液冲洗角膜。对照眼接受相同的方案，但应用溶液中缺乏胶原酶II型。

　　眼科检查：在手术前，兔眼接受裂隙灯检查，以证明结膜注射、角膜浸润和角膜基质炎症，在14天的研究中每天重复。

　　角膜曲率测量法：角膜曲率测量在手术前一天和手术后7天和14天用手持式角膜曲率计进行。在每个时间点进行八次测量，并在屈光度（D）中记录平均角膜曲率（KM）和Km的变化。

　　角膜厚度测量法：术前7天和术后第14天记录中央角膜厚度（CCT），在表面麻醉下使用手持测厚仪测量。在各时间点进行六次测量，记录平均CCT和CCT的变化。

　　生物力学测量：在第14天，静脉注射过量戊巴比妥钠使兔安乐死。从每个眼睛获得与相邻巩膜（2毫米宽）的整个角膜。一个4毫米宽的中央角膜条，包括2毫米巩膜两端，用双刀解剖刀沿垂直方向（12:00 - 6:00）切割。角膜带固定在微机控制试验机的夹具上，力为5 N。以3毫米/分钟的速度拉伸角膜条带，记录载荷和变形。弹性模量定义为拉伸应力（每单位截面积的角膜条带的变形量）与拉伸应变之比（由应力引起的长度的百分比变化）。

　　组织学：剩余的角膜标本用4%聚甲醛固定3天，石蜡包埋。然后将其垂直切成8μm厚的切片，用于苏木精-伊红染色。

　　结果：眼科检查：术后每日裂隙灯检查均未见结膜注射、角膜浸润及角膜基质炎症。荧光素染色检查显示在手术后约5天角膜上皮完全愈合。

　　角膜曲率测量法：术前，两组间的Km差异无统计学意义。手术后，实验组KM增加，对照组Km减少。实验组KM在第7天和第14天分别显著增加1.54±1.29 d和0.89±0.89D。与对照组相比，KM在两个时间点（第7天和第14天）均有显著变化。

　　角膜厚度测量法：两组术前CCT无显著性差异。实验组CCT在第7天和第14天分别下降了23.10±12.17μm和16.10±10.46μm。与对照组比较，CCT的变化在时间点（第7天和第14天）均有显著性差异。

　　生物力学测量：应力-应变测量显示暴露于胶原酶的角膜硬度降低。胶原酶处理后角膜弹性模量显著降低。5%、10%、15%、20%畸形角膜的弹性模量均低于对照角膜，两组在10%和15%畸形方面差异有统计学意义。

　　组织学：与对照组相比，实验组胶原纤维排列疏松，观察到层间裂。

　　结论：研究描述了兔胶原酶诱导角膜膨隆模型，模拟角膜的KC，角膜变薄，以及较低的弹性模量。该模型可用于进一步研究KC的发病机制，并评估这种疾病的新治疗方法。