儿童癌症模型 中国实验动物信息网 2020-12-11 738

　　儿童和青少年癌症：

　　儿童癌症是导致儿童和青少年（0-19岁）死亡的主要原因之一，主要包括白血病、神经系统癌症和肉瘤。为了更好地了解这类疾病的病因，*近的基因组分析工作已经使基于分子特征的肿瘤类型分型成为可能，并发现了潜在的基因驱动因素和协同的分子事件，这是导致不同儿童癌症发展的基础。大多数儿童恶性肿瘤是突变沉默的，被认为是由单个驱动基因、融合癌蛋白或结构/拷贝数改变引起的。相反，成人肿瘤常表现出高度的变异负担，这可能是由于在选择性压力下的长时间变异。然而，尽管存在这些差异，儿童癌症治疗仍然主要是仿效针对成人的治疗方法，当给儿童使用时，会导致衰弱、长期的副作用。为了设计更精确、更有针对性的治疗方案以改善儿童癌症患者的预后，*终有必要开发出能够准确概括这些疾病的强大的临床前儿童癌症模型。在这里，我们将讨论斑马鱼作为基因和药物发现的临床前模型如何促进儿童癌症领域的发展。

　　斑马鱼在癌症研究中的应用：

　　斑马鱼之所以被建立为一种发育生物学模型，是因为它特别适合于遗传学、胚胎学和影像学的发展，从而能够发现控制胚胎发生、神经发生和器官形成的新机制。这些特征也使斑马鱼成为研究癌症的一个有吸引力的模型，因为：（i）透明的斑马鱼胚胎和成虫能够直接观察体内肿瘤细胞的行为；（ii）斑马鱼动物的快速生产为遗传和药物筛选提供了高度可扩展的平台； 以及（iii）鱼类和人类之间癌症信号通路的显著保守使人们能够识别肿瘤发生的新分子机制。已经建立了超过50种人类癌症的基因工程斑马鱼模型，它们在组织学和/或基因组水平上与人类斑马鱼非常相似。斑马鱼癌症模型加速了发现新的驱动人类癌症的机制，并确定了用于临床试验的新药物。*近的许多评论详细介绍了产生不同的白血病，肉瘤，神经母细胞瘤和生殖细胞肿瘤模型的实验方法。我们关注的是基因工程斑马鱼系如何特别模拟儿童和青少年癌症，我们将其定义为斑马鱼肿瘤，在生命的*初90天内出现。

　　描述了斑马鱼幼年期（内圈）和青少年期（外圈）肿瘤的发生率及相应的肿瘤解剖位置。已经开发出用于儿童白血病，脑瘤，肉瘤，生殖细胞瘤和成神经细胞瘤的斑马鱼模型。这些斑马鱼模型的代表性组织学在右侧显示。 组织学图像来自：（T细胞急性淋巴细胞白血病），（中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤），（胚胎性横纹肌肉瘤），（生殖细胞肿瘤）和（神经母细胞瘤）。

　　白血病

　　急性淋巴细胞白血病（ALL）发生于骨髓中的T淋巴细胞和B淋巴细胞，是儿童*常见的癌症。目前，这些儿童的5年生存率高达90%以上，典型的治疗方法包括化疗和异基因骨髓移植治疗高危或复发病例。尽管这些患者的存活率很高，但目前的治疗方法仍存在许多长期有害的副作用。基于这些原因，目前的努力集中在降低治疗毒性和开发针对高危患者和复发性疾病患者的靶向治疗上。

　　T细胞急性淋巴细胞白血病（T ALL）

　　T-ALL占儿童所有病例的15％。T-ALL在胸腺中由未成熟的胸腺细胞形成，这些胸腺已获得遗传或表观遗传学变化，并迁移至骨髓，外周血和淋巴结。 T-ALL患者的遗传改变包括易位，基因融合，染色体获得和缺失以及表观遗传异常。儿童和成人T-ALL均在NOTCH，PI3K–AKT，JAK–STAT和RAS途径中表现出频繁的改变。T-ALL的早期斑马鱼模型概括了小鼠和人类的研究，并迅速确定了该疾病的肿瘤进展和存活的新机制。

　　Myc驱动的T-ALL斑马鱼模型

　　*个基因工程斑马鱼癌症模型被归类为T-ALL，其中rag2启动子被用来驱动小鼠原癌基因Myc在T和B淋巴细胞中的表达。在Tg（rag2:mMyc）转基因模型中，Myc的镶嵌表达诱导6%的动物T-ALL，平均潜伏期44天。Myc驱动的T-ALL条件生殖系转基因模型现已建立，使用三种诱导方法之一：（i）将Cre mRNA注入Tg（rag2-lox-dsRED-lox-EGFP-mMyc）胚胎（ii）将Tg（rag2:LDL-EGFP-mMyc）和Tg（hsp70:Cre）鱼杂交；（iii）用4-羟基他莫昔芬处理Tg（rag2：hMYC-ER）鱼。在这些精细模型中增加的重复性和肿瘤外显率使得能够识别新的基因和/或基因途径，促进或抑制Myc驱动的T-ALL的启动、进展和存活，以及发现抑制体内肿瘤发生的药物。

　　Notch驱动T-ALL斑马鱼模型

　　在超过60％的T-ALL病例中，NOTCH信号通路被异常激活，并且可以通过MYC依赖性和非依赖性途径促进T-ALL肿瘤发生。此外，在斑马鱼T-ALL发病过程中，NOTCH1和Myc协同作用，因为rag2介导的Myc和NOTCH1的组成性活性胞内结构域（NICD）的表达比单独的Myc或NICD的表达增强了T-ALL的进程。增强的Notch信号不能增加白血病增殖细胞的数量，表明Notch控制癌前细胞的增殖，而Myc主要驱动克隆细胞的生长和存活。在约16％的复发性儿童T-ALL病例中，Notch通路突变也与Hedgehog通路的激活有关。ptch1是Hedgehog途径的负调节因子，它的丢失加速了斑马鱼notch1诱导的T-ALL的发生，这表明Hedgehog信号途径的激活与notch1协同作用以驱动T细胞转化。这些斑马鱼模型突出了在T-ALL疾病进展期间靶向多种发育途径的治疗潜力。

　　B细胞 急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的斑马鱼模型

　　B-ALL占所有儿童期ALL病例的85％。 虽然B-ALL和T-ALL在形态上无法区分，但每种疾病的特征都是不同的分子亚型。在成人和儿童B-ALL中都存在类似的遗传和染色体异常，包括融合基因，如BCR-ABL1和ETV6-RUNX、MLL重排、超倍体和二倍体，尽管频率不同。此外，*近发现，来自Tg（rag2：hMYC）系的部分动物也患有B-ALL肿瘤，具有与T-ALL肿瘤不同的基因表达特征。表明该转基因系实际上是混合的模型。这些研究强调需要结合现代比较致癌学方法以验证斑马鱼系所模拟的人类肿瘤的确切类型和/或亚型。

　　急性髓系白血病（AML）的斑马鱼模型

　　急性髓系白血病的定义是由未成熟髓细胞聚集而成，至少占患者骨髓的20%。AML的5年总生存率为64%，但根据分子亚型的不同，存活率有显著差异。与其他液体恶性肿瘤不同，一些儿童AML患者的体细胞变异与成人AML患者明显不同。儿童急性髓性白血病的独特特征是基因融合事件，如AML1-ETO（也称为RUNX1-RUNX1T1）、NUP98-NSD1和KMT2A-MLLT3。hsp70启动子驱动的AML1-ETO的表达以及CMV启动子驱动的FLT3-ITD或FLT3-TKD的表达导致斑马鱼早期胚胎中的髓样细胞扩增。COX2抑制剂尼美舒利阻断aβ-连环蛋白介导的骨髓生成增加可以逆转AML1-ETO胚胎的造血缺陷。此外，用酪氨酸激酶抑制剂（AC220）治疗可使FLT3-ITD（而不是FLT3-TKD）中的髓样扩增消失，这表明存在着不同的治疗机会来治疗看似相似的遗传异常。这些研究表明斑马鱼胚胎对于理解造血中致癌融合基因的基本机制和发现治疗儿童白血病的新方法是有用的。

　　脑和中枢神经系统肿瘤

　　脑瘤和中枢神经系统肿瘤是导致儿童癌症相关死亡的主要原因。大约75%的儿童脑肿瘤是恶性的，5年总生存率为78%。此外，手术切除肿瘤、放疗和全身化疗会对发育中的大脑造成长期并发症。幸运的是，在儿童脑肿瘤的基因组特征方面取得了重大进展，已经确定了具有不同分子特征的特定脑肿瘤实体，从而能够更准确地对具有复发基因组特征的肿瘤进行分类。现在面临的挑战是为基因和药物的发现建立新的脑肿瘤实体的细胞和动物模型。斑马鱼似乎是一个很好的动物模型，用于检测OPC衍生的儿童肿瘤的基因驱动因素。例如，斑马鱼中nf1a/b或rb1抑癌基因的缺失，通常伴有p53缺陷，会产生类似于少突胶质瘤或类似于中枢神经系统PNET的胚胎性肿瘤的脑肿瘤。Tg（sox10：NRAS）模型和rb1缺陷模型之间的比较基因组分析表明，基因表达变化存在明显的重叠。

　　神经母细胞瘤斑马鱼模型

　　在约20％的神经母细胞瘤（NB）中观察到MYCN的扩增，与预后不良有关。用多巴胺-β-羟化酶（dβh）启动子将人MYCN基因定向表达给发育中的外周交感神经系统，建立斑马鱼NB模型。已开发出低（17％）和高（70％）外显率的NB斑马鱼模型，以检测协同突变，分别增加或减少肿瘤负担。低外显率NB模型Tg（dβh:EGFP-MYCN）表达EGFP-MYCN融合蛋白，而高外显率Tg（dβh:EGFP；dβh:MYCN）模型涉及EGFP和MYCN基因的共整合而非融合。在这两种模型中，斑马鱼NB肿瘤在组织学上与人类NB相似，主要出现在肾间腺，相当于人类肾上腺髓质。低外显率Tg（dβh:EGFP-MYCN）NB模型有助于鉴定与MYCN协同促进NB肿瘤发生的多种基因。

　　肉瘤

　　软组织和骨肉瘤占儿童癌症的7%。儿童和青少年*常见的肉瘤是横纹肌肉瘤（RMS）。它由未分化的肌肉细胞形成，通常出现在头部/颈部、泌尿生殖道或四肢。横纹肌肉瘤有两种主要的组织学亚型：胚胎型（ERMS）和肺泡型（ARMS）。ERMS占所有RMS病例的75%，其典型特征是在MYOD1、FGFR4以及任何一个编码主要RAS gtpase基因的11p15.5位点或点突变处失去杂合性。相比之下，80％的ARMS患者表现出PAX3–FOXO1或PAX7–FOXO1融合基因的过表达。RMS治疗仅限于局部切除、放疗和多药化疗，在过去50年中基本保持不变，尽管在下一代测序和患者分子分型方面取得了进展，ERMS的5年生存率仍为82%，ARMS的5年生存率为65%。斑马鱼RMS模型有助于我们了解这些儿童癌症的病因。

　　融合阳性肉瘤的斑马鱼模型

　　在p53基因缺乏的背景下，利用CMV启动子广泛表达人PAX3-FOXO1融合基因，建立了斑马鱼ARMS模型。因此，与ERMS模型相比，ARMS中的起源细胞是未知的。 尽管如此，这些研究表明，PAX3-FOXO1人类融合癌基因足以将斑马鱼细胞转化为具有独特组织学特征的ARMS肿瘤或CNS-PNETs。PAX3–FOXO1导致转录因子hes3在肌肉细胞中的异常表达，从而阻断肌肉分化标志物的表达。一直以来，人HES3在斑马鱼和肌肉祖细胞中的表达抑制肌肉生成，而在RMS患者中HES3的表达增加表明预后不良。因此，这一斑马鱼模型为研究PAX3-FOXO1融合基因介导肿瘤发生的保守遗传机制提供了重要的线索。事实上，对融合阳性肉瘤的研究有一个重要的进展，那就是利用斑马鱼系可快速检测融合癌蛋白的转化潜能，而不必事先知道肿瘤细胞的起源。

　　结论：与成人癌症相比，儿童癌症是一种罕见的疾病。因此，许多儿童肿瘤实体没有相关的细胞系或动物模型系统来定义疾病发病机制或测试潜在的治疗方法。在我们看来，斑马鱼系统对儿童癌症研究的*重要的好处是，能够及时和负担得起地开发罕见的肿瘤亚型，用于临床前药物发现，如前所述的白血病、脑肿瘤、NB和肉瘤。此外，斑马鱼独特的影像学特性为直接监测肿瘤细胞在侵袭和转移过程中的行为以及对药物治疗的反应提供了有力的工具。这些特征对于研究成人癌症同样重要。

　　斑马鱼和小鼠的儿童癌症模型在识别儿童肿瘤的新机制方面具有互补性。这两种模型系统都具有保守的发育和致癌途径，可用于患者来源的异种移植（PDXs），并具有可用的基因组编辑技术。斑马鱼在可扩展性、成本和成像方面具有独特的优势。相比之下，小鼠具有保守的生理特征（体温和器官系统）和更精确的药物输送、给药和代谢。