结核性脑膜炎 中国实验动物信息网 2020-12-09 586

　　简介：结核性脑膜炎（TBM）约占肺外结核病例的5%-10%，占所有活动性结核病例的1%，其是*致命的结核病。TBM在4岁以下儿童和老年人中的发病率和患病率较高，特别是患有严重肺结核和免疫功能低下的人。*近的一项研究表明，大约40%的病情恶化的TBM患者会在确诊后6个月内死亡。脑内炎症和脑损伤是TBM的主要特征。兔作为一种实验性TBM人类疾病模型，于1923年建立。*个TBM兔模型包括通过蛛网膜下腔注射人结核杆菌（推测为Mtb）、禽结核杆菌和牛结核杆菌。在生理盐水中制备的接种物在注射后在没有引起任何可见的反应。然而，在接种后6-15天，兔脑膜内产生结节，并伴有TBM症状，如瘫痪，随后死亡。这项早期研究证明了人TBM与兔TBM模型在疾病进展和免疫病理学上的相似性。重要的是，兔TBM模型的临床和脑脊液（CSF）表现与人类疾病非常相似，其中淋巴细胞占优势，蛋白水平高，CSF变得粘稠。此外，基底膜增厚和脑积水在兔TBM模型和人TBM的MRI中都是常见的异常。

　　人TBM兔模型的建立

　　我们的研究小组首先使用高毒性（HN878）或高免疫原性（CDC1551）临床Mtb分离株对兔进行脑内注射感染来评估TBM的严重程度。在这项研究中，使用了Dacey和Sande*初发表的TBM兔模型。在该模型中，第1天，在麻醉下用4个0.5×2英寸的铝螺钉固定兔颅骨，在细菌接种前肌肉注射氯胺酮（0.5 mL/kg）和二甲苯嗪（3.5 mL/kg）。将这些螺钉放置在颅骨的额叶，顶叶和枕叶皮质区域上。 距颅骨顶约1毫米，距矢状缝线约2毫米。使用Dura Base牙科丙烯酸树脂在螺丝顶部放一个半螺丝扣头盔。面罩使新西兰兔能够适当地放置在立体定位框架中。第2天，肌肉注射氯胺酮（0.5 mL/kg）和二甲苯嗪（3.5 mL/kg）对动物进行镇静，并使用0.25×4英寸的螺栓，将动物头部牢固地放置在立体定位框架内，该框架有助于穿透脑池进行细菌接种。将3.5×25 G的脊髓针插入脑池，并注射0.3 mL约含5×105 CFU的细菌接种物。 在感染后的指定时间点，收集脑脊液和血液样本以进行下游分析。

　　先前方法的基本局限性是潜在的继发感染，这是由于将丙烯酸头盔连接到颅骨所需的外科手术引起的。 此外，在短时间内（约3天）内对动物进行多次镇静以放置丙烯酸头盔并接种细菌。金属螺钉和丙烯酸头盔的放置以及多种镇静作用会给实验动物造成压力。此外，在这个模型中使用的立体定位设备没有适配器来固定新西兰兔的头部。新方法中的关键修改是使用了适配器，该适配器非常适合于立体定位框架，并且可以将新西兰兔牢固地固定在适当位置以进行脑池内注射。该方法还避免了多次镇静治疗，从而减轻了动物的压力。该方法专注于通过减轻疼痛和压力来改善动物福利。

　　所有动物操作，包括Mtb接种均在生物安全3级（BSL-3）设施中进行。以下所有步骤均应在II级生物安全柜（BSC-2）中执行。新西兰兔被安置在单独的负压笼中，并且笼被放置在负压室内。 在进行动物感染实验之前，必须在门上悬挂一个生物安全警示牌，警告其他人在试验过程中请勿进入。个人防护装备：一次性Tyvek套装、发帽、护目镜、一次性靴和双层手套。电动空气净化呼吸器(PAPR)应用于：（a）感染动物； （b）处理感染性悬浮液，以及（c）尸检。 其余过程可使用常规的N95面罩。

　　准备动物感染：

　　1、在BSL2/BSL3动物设施中，将体重为2.4-2.6公斤的无特定病原体新西兰大白兔单独饲养约一周，进行驯化。

　　2、感染当天，将新西兰兔移至BSL3设施，并通过肌内注射用氯胺酮（35 mg / kg）和赛拉嗪（5 mg / kg）镇静。 镇静后，通过隔离过滤箱将动物移至手术室。

　　3、使用电动剪毛器刮除新西兰兔头部枕骨周围的皮毛。

　　4、动物被放置在一个立体定位框架中，在一张不锈钢桌子上，以便于进行颅内穿刺。

　　细菌接种物的制备：

　　5、预先用1xPBS无菌生理盐水制备结核分枝杆菌悬液，浓度约为5×106cfu/mL。

　　6、在生物安全柜内将细菌悬浮液吸入1 cc注射器中。 使用特殊的安全装置将针断开，该安全装置位于动物框架旁边。

　　7、取下25 G脊柱针的中心导丝，将含接种物的1 cc注射器的柱塞向后拉，以在注射器尖端和接种物之间留出约0.2 cc的空气屏障。将针头小心地从1cc注射器上取下，并正确地连接到25g脊针上，保护套留在针头上。带有脊针和细菌接种物的注射器被放置在一个有盖的防漏转移容器内，容器顶部是用消毒剂浸泡过的纸巾。密封容器，并用DeconPLus 湿巾擦拭外部，放于立体定位框架旁边。

　　8、应将新西兰兔固定在立体定位框架内，以便于颅内穿刺。触诊以确定脑池的正确位置（直径约5毫米的凹陷区域，位于枕部突起下方）。然后用70%乙醇消毒注射部位。

　　9、使用装在1cc注射器上的无菌脊柱针抽出CSF（0.3 mL）样品。 该过程如下进行：取下脊髓针的保护套并将注射器固定在针基座上，然后在先前确定的位置以5 mm的增量逐渐向水平方向推进针。针头穿过软组织，直到感觉到适当的阻力消失为止。 缓慢拔出注射器柱塞时，可以确保在脑池内的针头位置； 没有血液和CSF证实了正确的定位（0.05 mL足以在注射器内可视化）。

　　10、取出注射器和针头，将脑脊液样本放入生物安全柜内的1.5mL微管中。用过的注射器被丢弃在锋利的容器中。将20微升样品加入一个带盖的特殊比色皿中，并填充缓冲液，使用库尔特细胞计数器测量WBC的数量。

　　细菌接种：

　　11、从转移容器中取出安装在1cc注射器上的脊针，该注射器含有0.2mL在步骤7中制备的细菌接种悬浮液，，然后小心地将柱塞推入以除去尖端的空气。 如果在注射器针尖上形成液滴，可使用带有结核杀菌剂的布来擦拭注射器。

　　12、逐步将针头水平推进，将注射器固定在基座上，在步骤9中以0.5 cm的增量水平递增，然后，在20–30 s内缓慢注射细菌接种物。

　　13、小心地取下带有脊针的空注射器，并立即放入利器盒中。

　　14、如有需要，可在注射部位轻轻按压纱布或纸巾，以止血。纱布或纸巾被扔进生物危害废物袋中。

　　15、将新西兰兔从立体定位装置中取出，放入带过滤装置的单独的转移笼中，并放入饲养笼中。此时，他们仍处于麻醉状态。

　　16、所有动物接种Mtb后，用10%氯氧漂白剂对立体定位架、下牵引台和推车进行适当消毒，使其接触20分钟，然后冲洗立体定位架。