单眼局限性感光细胞变性模型 中国实验动物信息网 2020-12-02 884

　　背景：视网膜色素变性（RP）是导致夜盲和*终丧失周边和中央视野视网膜退行性疾病。一些负责RP基因已经确定，其中大部分同光传导通路相关。这些研究结果还没有诱导发现有效的治疗或预防策略。视网膜假体通过刺激剩余的视网膜神经元引起幻视，已被研究作为潜在的工具来恢复这些患者的视觉。已经开发了各种啮齿类感光变性动物模型来进行视觉功能的研究。RCS大鼠携带Mertk基因自发突变导致光感受器变性。连续光照射是另一种技术，用于调查感光变性的机制。兔感光变性的模型将承担复杂的行为任务，更密切地模拟人类的视觉功能。我们报告了2种产生一个兔单眼感光变性模型方法。维替泊芬是一种光敏染料，用于临床，无任何副作用。在临床前研究中，维替泊芬和/或延长曝光量诱导光感受器和视网膜色素上皮细胞的损伤。维替泊芬用于局部视网膜光感受器变性诱导。硝普钠（SNP）是用于治疗高血压。SNP在血液中分解和释放一氧化氮（NO），作为血管扩张剂。在视网膜中，过量NO诱导光感受器变性。玻璃体腔注射硝普钠诱导广泛性感光变性。两维替泊芬和SNP诱导光感受器变性对对侧眼没有明显的影响。感光变性的单眼模型的好处包括使用的同一只动物眼睛作为一种对照，这减少了实验动物的使用数量。

　　方法：按照说明书使用维替泊芬。在我们的研究中，我们使用了一个卤素反射灯作为光源。维替泊芬2mg溶于无菌蒸馏水7ml，使用5%葡萄糖溶液调整浓度至0.1mg/ml.溶液按照0.5mg/kg静脉注射，速度为1ml/min。SNP溶于生理盐水，不同浓度的SNP在兔眼玻璃体腔内注射。使用18只雄性荷兰兔。家兔麻醉使用氯胺酮（66 mg/ml）和甲苯噻嗪（33mg/kg）肌肉注射混合麻醉。使用维替泊芬诱导视网膜变性，用1%阿托品和2.5%盐酸去氧肾上腺素放大瞳孔后，视网膜被暴露在距离角膜10毫米的卤素反射灯下。第二模型，眼局部应用盐酸奥布卡因，使用手术显微镜、作小切口以暴露巩膜，结膜和30号针头将SNP溶液100μL注射玻璃体内。两周后，使用手持式眼底照相机进行眼底照相。治疗后1个月获取ERG记录。白兔暗适应过夜，用1%阿托品、2.5%盐酸去氧肾上腺素散瞳，而0.5%盐酸丙美卡因角膜麻醉。金丝环小接触镜片放置在角膜，银丝参考电极置于皮下的眼睛之间。由一个白色的LED脉冲激活产生闪光，光刺激持续时间为10毫秒。记录全场暗视ERG，带通滤波在0.3到500赫兹，并取每个光照强度的5个响应的平均值。接地电极夹放在尾上。白光LED（7500Kelvin）用于白刺激。分析维替泊芬和SNP处理的眼睛视网膜形态按照Tomita等人先前描述的进行。用戊巴比妥钠静脉注射处死动物。摘除眼球固定、石蜡包埋，切三微米厚的视网膜，用苏木精-伊红染色。统计分析采用GraphPad Prism软件进行，统计意义的标准为P＜0.05。

　　结果：没有光照曝光的未处理组和维替泊芬组没有明显变化。曝光后维替泊芬治疗组或硝普钠玻璃体腔内注射诱导视网膜萎缩。萎缩的程度取决于曝光持续时间或SNP浓度。当维替泊芬治疗视网膜暴露于光，即使只有10分钟，视网膜色素上皮细胞（RPE）色素沉着能清楚观察到。随着光照时间的延长，色素沉着明显被标记为RPE萎缩。维替泊芬加光照射引起的病变明确限制暴露于光的区域。然而，通过SNP可引起周边视网膜变性的。荧光血管造影显示注视1毫摩SNP的视神经周围有出血。ERGs振幅（a和b波）在维替泊芬治疗眼比未处理眼略有下降。b波振幅随着曝光时间持续而下降。SNP处理眼睛，振幅随SNP浓度增高而下降。即使仅注射0.1毫摩SNP，ERG的b波振幅明显降低。维替泊芬治疗无光照射不诱导光感受器变性。然而，视网膜的神经变性（主要是感光细胞）发生至少需曝光10分钟。在SNP诱导的退化模型，病变包括周边视网膜内层和感光层。

　　讨论：光敏染料维替泊芬被广泛应用作为光动力疗法（PDT）的一部分用于CNV的治疗。然而，PDT不是纯粹性选择脉络膜和可能导致视网膜的损伤。PDT诱导剂量依赖性损伤感光细胞和视网膜色素上皮细胞。随着特定波长的吸收，产生氧自由基，这对感光细胞和视网膜色素上皮细胞是有毒的。眼底摄影显示：静脉注射维替泊芬后，暴露于光照后引起的光感受器损伤被局限在光照区域。通过光化学反应，SNP释放出一氧化氮，通过各种方式减少代谢产物包括硫醇，含微粒体生物细胞器。NO参与多种视网膜功能，内源性NO增强光适应过程中的锥体反应，有时会导致视网膜毒性及有助于缺血引起的损伤。在正常情况下，在缺血或连续激烈的光暴露，引起视网膜变性的严重程度取决于局部NO水平。

　　结论：我们的研究结果强调了诱导兔视网膜色素变性的2种方法：通过光照和SNP引起的。在维替泊芬-曝光模式，光感受器变性可以限制暴露于光的区域。此模型对诱导局部感光病变是有用的，如发生年龄相关性黄斑变性。与此相反，SNP诱导整个视网膜光感受器变性。