黑色素瘤动物模型 中国实验动物信息网 2020-12-02 899

　　摘要:    葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞系，当暴露在体外的蓝光下，显示增殖能力显著增加。为了确定在体内是否可以看到类似的效果，我们研究了蓝光照射对异种移植物动物模型的影响。方法:    二十新西兰白兔在右眼脉络膜上腔注射1×106人的葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞。动物平均分为两组，实验组暴露于蓝色光，而对照组免于蓝光照射，动物死亡后摘除眼球后用酸性桃红-B法评估再培养肿瘤细胞的增殖率。细胞重新培养为为了保持细胞在体内的任何变化。此外，增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达被用来确定福尔马林和石蜡包埋（FFPE）眼睛固定两组之间细胞增殖的差异。结果:   在统计学上蓝光照射导致眼内肿瘤细胞株增殖显著增加（P<0.01）。与对照组相比，FFPE蓝光治疗组PCNA的表达显著增高。结论:    越来越多的数据表明，蓝色光暴露可能会影响黑色素瘤的进展。我们的研究结果支持这一观念，并保证进一步的研究，来评估蓝光滤光镜对减缓黑色素瘤疾病进展的能力。

　　介绍:    葡萄膜黑色素瘤（UM）是成年人*常见的眼内恶性肿瘤。UM的发病率范围每百万有4.3至10.9例，取决于诊断这种疾病的具体标准。虽然它是一种相对少见的恶性肿瘤，大约50%的*初被诊断为UM的患者将在10到15年内*终发展为肝转移瘤。本病的前兆包括脉络膜痣的存在，它经常发生在老龄化的人口中。随着年龄的增长，人类的晶状体变得越来越黄。这一过程被认为泛黄的晶状体能有效的过滤更多的蓝色光线。白内障手术后，去除老龄化的晶状体同时也伴随着自然蓝光过滤能力丧失。进一步的研究表明，蓝色光暴露可能在黑素细胞的恶性转化中发挥作用，*终可能导致黑色素瘤的发展。先前已经表明，长期暴露蓝光的大鼠，病理诊断为眼内黑色素瘤。

　　方法:   动物   二十雌性新西兰白兔随机被分为两组，对照组和实验组，平均初始体重分别为3.2±0.18公斤和3.2±0.17公斤。使用雌性动物时为避免冲突，雄性动物群养时可能会出现打斗情况。动物每日使用环孢素A（CsA）皮下注射用来免疫抑制，避免对人类细胞的排斥。实验CsA使用时间为8整周，防止肿瘤回归。在过去的4周的实验CsA使用以前的研究中建议的剂量时间表：细胞接种3天之前15mg/kg/day，并在4周后，其次是10 mg/kg/day。CsA剂量每周根据动物的体重减少来进行调整。

　　细胞系和细胞注射程序:  注射过程和随后的动物处理按照先前描述的进行。92.1人原葡萄膜黑色素瘤细胞系，是由安东尼亚博士从研究所友情提示的。这种细胞系的选择是基于我们的实验室以前的研究，这种细胞系在体外表现出高的增殖和侵入性潜力。细胞在37°C 5%的CO2条件下培养。细胞在RPMI-1640培养基培养辅以5%热灭活胎牛血清、1%两性霉素B（Invitrogen）和1%的青霉素链霉素。悬浮在中，根据先前描述的技术，0.1毫升的培养基中含一百万（细胞存活率大于99%）细胞将注射到每只兔右眼脉络膜上腔。手术过程中使用氯胺酮（35 mg/kg；）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）进行麻醉。

　　蓝光照射: 本实验所用的20只兔子随机分为两组，分别为10只。实验组兔每天8小时暴露于蓝光持续8周时间。动物们被安置在一个大的围栏中，里面放置蓝色发光装置。该装置是一个大的金属笼子，其中二十四个6600K灯泡被暂停，每一个由一片聚碳酸酯薄膜覆盖，允许只有在蓝色部分的频谱光通过。该装置被放置在笼的中间，悬挂的灯泡到达地面约6"，以获取眼睛水平的*大光照。此外，该笼内衬3'高反光铝以确保笼内所有领域获得足够的蓝光。所有的灯都连接到一个定时器，在上午11点打开，并在晚上7点关闭。在蓝光照射期间，提供给所有进入房屋区域人员防护镜。对照组放在相邻的笼中，由一个聚碳酸酯膜覆盖确保阻挡可见光谱的蓝色部分进入对照笼。

　　眼底检查: 用托品酰胺进行扩瞳，间接检眼镜进行眼底检查。细胞接种前排除任何现有的眼部疾病，和每周细胞接种后记录临床眼内肿瘤的发展。

　　安乐死:接种细胞进入眼睛两周后，每一组每周一只动物被安乐死为了记录疾病的时间进展，特别是肿瘤转移的发展。选择的标准是基于动物的外观，CsA毒性和兽医的建议。其余的兔子组（n = 4），在实验结束时牺牲。安乐死的方法是通过肌肉注射氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉后心脏穿刺放血（35mg/ kg-5 mg/ kg）。对被处死的每一只动物进行尸检。去核的眼睛和可能转移疾病其他器官，如采集肺部，肝脏和肾脏标本保存在10%中性福尔马林缓冲液。福尔马林固定，石蜡包埋切片的标本进行组织病理学评估，苏木精和伊红染色。

　　安乐死后细胞的再培养: 每只兔子的右眼进行处理之前，用甲醛固定来获得一个新鲜的肿瘤样本。细胞在含5%胎牛血清的RPMI中培养并在接种前长满平板为了开展增殖试验。在安乐死期间，从心脏穿刺收集的所有血液通过Ficoll-Paque?方法处理为了获取白细胞层。整个实验持续时间这样做是为了捕获和记录肿瘤细胞（CMCs）的存在。CMCs可以黏附在六孔板的底部，而其余的非贴壁的白细胞会被洗掉。在接种实验开始前，CMCs长满平板。所有重新培养细胞（原发肿瘤，CMCS）传代一次为了维持这些细胞在体内可能存在的表型变化。

　　免疫组织化学:  使用该基准的全自动仪器进行免疫组化。全自动化条码标记切片的处理包括切片的烘烤，无溶剂脱蜡，和CC1（Tris/ EDTA缓冲液pH 8）抗原修复。切片用小鼠抗人单克隆增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（1:200稀释）37°C 孵育30分钟。其次是生物素标记的第二抗体中的使用（37°C ，8分钟）及抗生物素蛋白/链霉亲和素酶共孵育（37°C ，8分钟）。*后，使用快红显色底物及HE染色检测抗体。作为阳性对照，人的小肠和结肠标本进行PCNA抗体。阴性对照组的主要抗体被省略。在肿瘤标本及周边眼组织PCNA核表达切片被分析。总共10只兔异种移植被用来进行分析。对总的肿瘤阳性率和强度也进行了评估。

　　免疫细胞化学: 培养的细胞被稀释到250000个细胞/毫升的浓度，和一个300微升该浓度的溶液均匀地被放置分布在每个平板上。所有切片用抗人单克隆抗体对黑素小体免疫组化染色主要使用Ventana?自动免疫染色机，使用标准的亲和素-生物素复合物的方法。病理学家认为HMB-45识别葡萄膜黑色素瘤细胞的存在是一个行之有效的标记方法。这些方法是为了确保再培养的细胞是葡萄膜黑色素瘤细胞。

　　结果: 眼底检查  在*周的时间点，对照组的两只兔和实验组的3只兔被检测出眼内肿块。到3周时，对照组和实验组可见肿瘤总数分别为4和5。这些数字保持不变，直到实验结束。

　　组织病理学研究   在对照组的6只动物和实验组的4只动物宏观可检测出眼内物质。眼球组织病理学评估显示对照组七只发展肿瘤、实验组5只发展肿瘤。在任何一组没有发现宏观转移性疾病。对照组的四只动物和实验组的4只动物中肺连续切片显示转移性疾病。未见肝转移。两组间差异无统计学意义。

　　安乐死后细胞的再培养: 对照组共有5例原发性肿瘤和实验组4例原发性肿瘤成功地重新培养用于后续的筛查分析和增殖实验。此外，对照组2个和实验组1个CMC培养物用于后续筛查和增殖试验分析。

　　免疫组织化学   所有的石蜡对照组兔眼显示PCNA阴性 (n = 5)。石蜡蓝光治疗组3只兔眼，强阳性表达（85-100%）；2只兔眼，与PCNA染色后有轻度阳性（n = 5）。

　　免疫细胞化学: 所有重新培养样本（原发肿瘤，CMCS）单克隆鼠抗人黑素细胞标志物染色显示阳性。这种特异性阳性表明所有在增殖实验中重新培养细胞确实存在*初接种到家兔眼睛的人葡萄膜黑色素瘤细胞92.1系。

　　结论: 总之，我们目前的证据表明，蓝光照射可以影响葡萄膜黑色素瘤细胞，进一步证实了以前的体外研究结果。我们的数据表明蓝光照射后葡萄膜黑色素瘤细胞增殖显著增加。这些数据需要进一步调查评估蓝光滤过人工晶状体对放慢葡萄膜黑色素瘤进展的疗效。