软骨细胞退变模型 中国实验动物信息网 2020-12-01 483

　　目的：在真核细胞中表达人Wnt7b基因并且观察对大鼠原代软骨细胞的退变作用。

　　方法：取出生24 h SD大鼠关节处软骨，Ⅱ型胶原酶多次消化后获得原代软骨细胞，取P1 代细胞进行实验。扩增人Wnt7b 基因及克隆至PCDH-GFP 上，转染PCDH-GFP和PCDH-Wnt7b 至293ft 细胞中，48 h 后收集细胞上清及转染细胞，Western blot 鉴定Wnt7b 在293ft 细胞中的表达。收集的上清分别稀释10倍和50倍培养大鼠软骨细胞，24 h后观察细胞形态并收集细胞蛋白和抽提RNA，Western blot和定量PCR检测软骨退变指标MMP13、MMP3、Ⅱ型胶原、A-can、ADAMTS5、ColⅩ和SOX9的表达。

　　结果：成功克隆人Wnt7b基因至PCDH-GFP载体上且在293ft细胞中得到有效表达。含Wnt7b培养基干预软骨细胞24 h后，软骨细胞形态由原来的多角形变成长梭形，Wnt7b处理组软骨细胞MMP13和MMP3表达显著上调，Ⅱ型胶原的表达下调。PCR结果表明A-can和Sox9表达下降，ColⅩ和ADAMTS5表达增强。

　　结论：有效在真核细胞中表达Wnt7b基因并且促进大鼠软骨细胞退变，建立软骨细胞退变的体外模型。