视网膜毒性,L-谷氨酸 中国实验动物信息网 2020-11-20 502

　　简介：谷氨酸，视网膜中的兴奋性神经递质，已知会引起兴奋毒性，这种现象中神经元细胞死亡发生在过度兴奋性神经递质之后。兴奋毒性与中风、低血糖、创伤、癫痫和慢性神经退行性疾病有关，如获得性免疫缺陷综合征痴呆综合症、肌萎缩性侧索硬化症和阿尔茨海默病。在视网膜中，兴奋性毒性被认为在视网膜缺血/再灌注损伤中起重要作用，在青光眼的神经元丢失中起重要作用。谷氨酸致兴奋毒性动物模型已证实由内界膜组成的内视网膜向内核层变薄。表明谷氨酸不仅损伤RGC，还损伤其他视网膜内细胞。然而，谷氨酸对视网膜内细胞的兴奋毒性作用还没有阐明。谷氨酸诱导新生大鼠视网膜损伤是谷氨酸诱导视网膜兴奋性损伤的动物模型。新生大鼠的视网膜发育不完全，大约需要3周才能成熟，视网膜损伤的程度取决于服用谷氨酸时的年龄。本实验通过在出生后各天皮下单次注射1-谷氨酸(PND)观察新生大鼠视网膜兴奋性毒性，并通过形态学和形态计量学方法评价谷氨酸诱导的视网膜损伤和各发育阶段的靶细胞。

　　动物：购买SD孕鼠，自由饮水和采食。在实验1中，新生SD大鼠分为14个给药组，每组2只。每组动物称重，每克体重2.4 mol/L谷氨酸，剂量10μl皮下注射1次。注射日期从PND 1到14不等(例如，第1组大鼠只注射PND 1，而第14组大鼠只注射PND 14)。动物从接受注射开始，每天观察直到PND21。所有组均在21天时结束异氟醚麻醉下放血，取出眼睛以作进一步分析。未经给药的正常动物在PNDS 1至14或21终止，并摘取眼睛。在实验2中，新生SD大鼠分为4个给药组，每组6只。每组动物称重，皮下注射10ul的每克体重 2.4mol/L谷氨酸钠。注射的时间在PNDS 4, 6, 8和10。给药后6小时取眼进行凋亡细胞分析。

　　组织固定：实验1用4%磷酸缓冲戊二醛固定右眼，5%磷酸缓冲福尔马林后固定，石蜡包埋，3um切片，HE染色。左眼后部用10%磷酸缓冲福尔马林固定1小时，包埋于*佳切削化合物中，保存在-80℃直至用于免疫组织化学。实验二用4%磷酸缓冲戊二醛固定每个PND的2只大鼠的眼睛，5%磷酸缓冲福尔马林固定后HE染色。用10%磷酸缓冲福尔马林固定每个PND的2只大鼠的眼睛，石蜡包埋，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP地高辛缺口末端标记。2只大鼠后眼用10%磷酸缓冲福尔马林固定1小时，冷冻保存在30%蔗糖中，并嵌入OCT化合物中。冷冻保存组织切片采用间接荧光法进行免疫组织化学标记。分别在100℃和105℃柠檬酸缓冲液中孵育15分钟，进行Chx10和Pax6免疫染色的抗原回收。在pH为7.6的50 mM TrI缓冲盐水（TBS）中，1%牛血清白蛋白（BSA）中阻断视网膜切片20分钟。初级抗体在TBS中用1%BSA稀释，组织切片在4℃下与抗体隔夜孵育。在TBS洗涤后，在室温下同二抗孵育1小时。包括兔抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）或山羊抗兔IgG与Alexa TM 488结合（绿色荧光）。用TUNEL方法标记凋亡细胞。测量视网膜总厚度（从内结膜到色素上皮）和视网膜内厚度（内界膜至内核层）。在中央视网膜(距视盘约500um)和外周视网膜(距睫状体两侧约500um)处进行测量，计算视网膜内比率[(视网膜内厚度/视网膜总厚度)×100]。

　　结论：视网膜中央区的组织病理学：我们通过对PND 21进行组织病理学检查，评估了PNDs 1到14 新生大鼠视网膜对谷氨酸的年龄依赖性敏感性。PND 1大鼠无明显变化。然而，在PND 2给药的大鼠视网膜内，与正常大鼠相比，视网膜轻度变薄。在PND 6给药的大鼠中，内核层仅能识别2-3层核，而正常大鼠有4-5层核。此外，神经纤维层至内侧丛状层表现出变薄。在PND 8给药的大鼠视网膜中央视网膜层几乎完全缺失。PND 10大鼠视网膜内变薄较PND 8大鼠轻。PND 14给药组大鼠视网膜内层厚度与正常对照组相同。在任何PND上用L-谷氨酸给药的大鼠外视网膜未见变化。首先在PND 2给药的大鼠中观察到谷氨酸诱导的视网膜中央变薄，在PND 8给药的大鼠中*明显，随后给药的大鼠变薄减弱。

　　视网膜内的初始变化：为了研究单次给予谷氨酸对视网膜的初始改变，在PNDS 4, 6, 8和10给药后6小时进行病理组织学检查。视网膜内选择性地出现许多核团，其中一些为TUNEL阳性。大多数核团位于内核层的内部区域。PND 8大鼠核固缩核数出现高峰，PND 10大鼠可见少量核团。固缩核数目与视网膜内层变薄程度相关，提示谷氨酸诱导的细胞凋亡是视网膜内层变薄的原因。

　　核内层的免疫组织化学分析：由于内核层由多种类型的细胞组成，所以对PND 21进行免疫组织化学分析，以鉴定经PND 6、8和10给药的大鼠内核层中的谷氨酸靶细胞。使用PAX6、CHX10、蛋白激酶C（PKC）α、钙结合蛋白和谷氨酰胺合成酶（GS）作为无长突细胞、泛双极细胞、杆双极细胞、水平细胞和Müller细胞标记物。PAX6和CHX10定位于细胞核，而PKCα、钙结合蛋白和GS在细胞质中。正常大鼠内核层3～4层可见Pax6阳性细胞，外核层2～3层可见Chx10和PKCα阳性细胞。钙结合蛋白阳性细胞散布在内核层外缘，GS阳性细胞分布在内核层中部的1层中。在PND 6给药的大鼠中，Pax6阳性细胞的数量减少到2到3层，而其他细胞类型标记物的阳性细胞数量与正常相同。. 在PND 8给药的大鼠中，Pax6-和Chx10-阳性细胞减少到1层，PKCα阳性细胞分散，而钙结合蛋白阳性细胞未检测到。GS阳性细胞在所有标本中均相同。PND 10给药组大鼠无明显变化。结果表明内核层谷氨酸靶细胞为PND 6上的无长突细胞、PND 8上的无长突细胞、双极细胞和水平细胞。我们还通过免疫组织化学分析在给药6小时后视网膜对谷氨酸给药的初始变化。在PND 8给药的大鼠中，Pax6阳性细胞的数量显著减少，而其他标记物的阳性细胞没有变化。正常大鼠内核层内可见Pax6阳性细胞，内核层是细胞核固缩的主要部位。因此，谷氨酸对PND 8细胞核层内影响*大的细胞是无长突细胞。

　　外周视网膜的组织病理学：化学物质引起视网膜病变的程度在中央和周边视网膜偶尔有所不同。比较外周视网膜和中央视网膜中PND 21的病理组织学变化。与正常视网膜相比，PND 2大鼠周围视网膜内的视网膜也变薄。在PND 8给药大鼠视网膜中，视网膜内层非常薄，但仍然存在。与中央视网膜相反，内层几乎消失了。PND 10大鼠视网膜内变薄较PND 8大。PND 14给药组大鼠视网膜内层厚度与正常对照组相同。在随后的PND给药中，周边视网膜的损伤类型和程度与中心视网膜相似，但周边视网膜的内层变薄程度比中心视网膜的轻微。

　　结论：谷氨酸诱导的视网膜变薄是由于视网膜内细胞的凋亡，这种作用在PND 8给药的大鼠的中央视网膜内*明显，而PND 9给药的大鼠的外周视网膜内*明显。在PND 8给药的大鼠，视网膜中央变薄比周围视网膜更严重。L-谷氨酸可使无长突细胞、双极细胞和水平细胞减少。幼龄大鼠，无长突细胞，而不是双极或水平细胞受损。视网膜损伤的年龄依赖性差异可能是由于新生大鼠视网膜细胞发育阶段的差异。更详细地研究谷氨酸诱导的视网膜不同发育阶段的损伤，有助于阐明兴奋毒性相关视网膜疾病的发病机制。