动物实验,亚慢性毒性,安全性药理 中国实验动物信息网 2020-11-17 449

　　背景：临床上使用的中药大约有12000种，其中大部分是草药，中医的起源和发展是劳动人民的实践经验和医疗实践。然而，许多常用中药的安全性和有效性还没有建立起来。为了保证中药的安全，有必要进行亚慢性毒性和药物安全性测试。金清颗粒由一种混合提取物，含有配方比例的金果榄和青果。在早期的试验中，金果榄对幽门螺杆菌感染的预防和早期治疗有效。尽管金清颗粒用于治疗各种疾病，长期使用的安全性仍值得商榷。大约10%的世界人口患有胃溃疡，大约1%的溃疡进展为胃癌。因此，金清颗粒有非常大的市场。在早期的急性毒性实验，我们发现金清颗粒对大鼠的半数致死剂量为5克/公斤。

　　方法：金清颗粒：金果榄和青果药材均采自成都。金果榄和青果按比例配方添加一些辅料制成金清颗粒。颗粒溶于灭菌蒸馏水中配成16 g/mL, 8 g/mL, 4 g/mL和 2 g/mL的剂量浓度。

　　动物：健康雌雄SPF级SD大鼠，4-8周龄。动物房间饲养温度20-25度，湿度55 ± 5%。人工照明12-12明暗调节。大鼠自由饮水，实验开始前驯化7天。

　　安全性药理实验：安全性药理实验按《兽药管理规范》进行。50只SD大鼠随机分为5组（每组5只，雌性5只）。*组，正常对照组（蒸馏水）；II组，2 g/kg金清颗粒；III组，4 g/kg金清颗粒；IV组，8 g/kg金清颗粒；V组，16 g/kg金清颗粒. 每天上午9时给予动物灌胃，体积为10毫升/公斤，持续7天。从上午10点到下午16点持续14天观察动物的行为、姿势、流涎、瞳孔改变、肌肉震颤、毛发和粪便。为了防止由于药物在体内累积导致的动物死亡后被惨食，及时对濒死和死亡鼠进行尸检。在给药结束前和给药结束后24h，将大鼠置于全身运动记录仪中，使其适应环境30分钟。通过观察大鼠的运动记录他们的活动（1分钟的移动次数），以确定中枢神经系统是否正常。

　　采用爬杆试验，对大鼠多次服药后的运动能力进行评价。*后一次给药后24h，一根光滑的金属杆竖起来固定在底部。把老鼠放在金属棒的顶部，允许它们头朝下。他们的协调活动能力分为：0级，正常的一步一步爬下；1级，滑行；2级，不能挂在杆上；3级，一段时间的不协调。用药前一天、给药后当天及给药后第8天，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠。BL-420F多道生理信号采集处理系统记录动物的心率、心电图、呼吸深度与呼吸频率。

　　亚慢性毒性试验：120只大鼠随机分为6组（每组雄性10只，雌性10只）。*组，正常组；II组、生理盐水对照组；III组，2 g/kg金清颗粒；IV组，4 g/kg金清颗粒；V组，8 g/kg金清颗粒；VI组，16 g/kg金清颗粒，大鼠给药剂量10毫升/公斤。每天上午9时给予动物灌胃，体积为10毫升/公斤，持续30天。为分析大鼠死亡原因，需要对死亡鼠进行解剖分析。每天上午10时至下午16时，观察大鼠的行为、态度、唾液的存在、瞳孔变化、肌肉震颤、毛发质地、食物摄入量、饮水量、粪便、中毒和死亡，持续30天。每三天记录一次体重。用药结束时，采集所有动物尿液标本。测定pH值、抗坏血酸、比重、血糖、白细胞计数、亚硝酸盐、蛋白质、酮、尿胆原、胆红素。在含有枸橼酸钠的抗凝管中采集约2毫升血液，以测定血液学指标。另一个2毫升的血液收集非肝素化管测量血清生化。取血后处死大鼠，观察可能的病理变化。记录肝脏、心脏、脾脏、肺、肾、脑、卵巢和睾丸的重量。根据公式计算器官的相对重量：脏器系数=脏器重量/体重×100%）。用10%福尔马林缓冲液（ph值7.4）浸泡三天，脱水、包埋、切片、脱蜡、HE染色。尼康80i光学显微镜评估病理改变。

　　结果：安全性药理实验：在安全药理学实验中，无死亡病例发生，所有组的所有动物，没有异常的皮毛，姿势、运动、粪便、流涎、肌肉震颤。各剂量组大鼠中枢神经系统控制的行为，如姿势，瞳孔大小的变化，流涎，步态，肌肉震颤无明显异常。金清颗粒各剂量组动物活动指数各项指标无差异。金清颗粒对大鼠自发活动无明显影响。在爬杆试验，治疗组和对照组大鼠均一步一步爬下，即为0级。证实金清颗粒对动物的协调没有明显的影响。用药前、用药当天和用药后第8天测量心率和呼吸率显示对照组大鼠和使用金清颗粒的剂量组之间无显著差异。同时，在同一组三个不同时间点，心率和呼吸频率无显著性差异。因此，得出结论：金清颗粒对大鼠心血管和呼吸系统无明显影响。金清颗粒对大鼠呼吸时间作用曲线见图。

　　亚慢性毒性试验：在30天灌胃试验中，第六组2只雄性和1只雌性大鼠死亡。这些动物的尸检结果显示为灌胃后不适导致的死亡。口服金清颗粒后未出现毒副反应。各剂量组动物的皮毛，动作，姿势，瞳孔变化、饮食、流涎、肌肉震颤，和粪便未发现有异常。饮食和饮水的消耗量见表。饮水量对照组和口服金清颗粒各组间差异不显著。摄食量除16克/公斤（VI组）消耗量略少外，其他各组无明显差异。体重增长对照组（I组）与生理盐水组（Ⅱ组）无显著性差异。给药组III - V（口服2克/公斤至8克/公斤金清颗粒）体重增长差异不显著。VI组（口服16克/公斤金清颗粒）雄性大鼠与对照组相比，体重增长略少。从第十九到第三十一天第六组雌性大鼠的体重增加也有类似的下降。尿液样本的指标表明，抗坏血酸的阴性率高达90%。所有动物的pH值、比重、血糖、白细胞、亚硝酸盐均正常。相比于对照值，VI组（口服16克/公斤金清颗粒）胆红素的值略有增加。潜血、蛋白、酮体、尿胆素原的值略有增加，但未达到统计学意义。除了VI组（口服16克/公斤金清颗粒）淋巴细胞计数稍高外，其他剂量组没有显著差异。血清生化指标，仅VI组（口服16克/公斤金清颗粒）天冬氨酸转氨酶及总胆红素有增高，其他组无显著差异。仅VI组（口服16克/公斤金清颗粒）肝脏和卵巢的脏器值略高，其他组无显著差异。每组取3只大鼠进行心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑、睾丸、卵巢的组织病理学检查。接受16 g/kg剂量金清颗粒的动物出现组织损伤。每组有完整的被膜及心室和心室肌轮廓，没有明显的病理损伤。与对照组相比，VI组动物肝脏肝窦扩张，不同程度的肝细胞空泡变性。脾脏，对照组动物包膜完整，白髓与红髓分界明显，淋巴细胞数正常。与对照组相比，第VI组大鼠淋巴细胞减少，巨噬细胞数量增多。各组肺组织均完整，所有支气管（一级支气管、二级支气管、三级支气管）排列整齐。肾组织病理改变不明显。肾包膜完整，皮质和髓质分界清楚，肾小管及集合管排列整齐，密度正常。*组至第六组胃内单层柱状上皮、粘膜肌层和固有肌层结构完整。肠道粘膜、粘膜下层、肌层、外膜层结构完整。脑内神经纤维层、大脑皮质、海马锥体细胞排列整齐、紧密，无炎性浸润或出血灶。卵巢组织中，从I组到第VI组，卵巢原始卵泡、增殖卵泡和成熟卵泡的形态和数量与对照组相比均正常。睾丸内生精小管结构完整，睾丸管内生精细胞排列整齐紧凑。与对照组相比，第六组动物生精小管内精子数量减少。

　　结论：大鼠接受高剂量金清颗粒(16克/公斤)安全药理学和亚慢性毒性试验显示对动物的神经、心血管、呼吸、肾脏和血液系统的毒性小。*高剂量导致动物体重增长稍慢，微小的组织学改变，精小管的精子数减少，血清天门冬氨酸转氨酶和胆红素升高。30天喂养试验中，3只接受16克/ kg剂量的大鼠死亡，可能是由于口服灌胃损伤所致，而非药物毒性。SD大鼠口服30天金清颗粒，剂量8克/千克或更少，是安全颗粒，更高的剂量不能证实是安全的。