兔模型：组织工程骨膜修复不规则骨缺损

修复不规则骨缺损

中国实验动物信息网

2020-10-22

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　　背景：在先前的研究中，成功地通过组织工程化的骨膜（TEP）修复了长骨缺损，，该骨膜是由兔骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层结合而成。本研究探讨TEP修复同种异体不规则骨缺损的可行性。

　　方法：对36只家兔施行肩胛骨次全切除术，建立大面积不规则骨缺损模型。将兔随机分为3组（每组12只），分别用TEP（第1组）、同种异体脱蛋白骨（第2组）或TEP与DPB的混合物（第3组）处理骨缺损。术后4、8、12周处死家兔，取出植入物。进行X线放射学和组织学检查以检测骨愈合情况。采用甲醛墨汁灌注法对TEP工程化新骨的血管化进行定性分析。

　　结果：所有组别的肩胛骨缺损修复方式各不相同，影像学和组织学检查显示。第8周和第12周，第1组和第3组的影像学评分明显高于第2组。组织学评分进一步证明，与第3组相比，第1组有更多的新骨形成，而第2组在所有时间点的成骨率*低。甲醛墨汁灌注显示TEP新生骨中有丰富的微血管。

　　结论：我们的结论是，TEP在修复大面积不规则骨缺损方面是有前途的。DPB作为一种三维支架，与TEP相结合可以提供机械支撑和成型导向。

　　简介：巨大的骨缺损仍然是骨科医生面临的挑战。骨组织工程是一种有前途的骨缺损修复方法。经典的BTE方法是选择一种生物材料支架，该支架为3D骨组织的形成提供结构支持。但是，这导致骨骼组织再生受限，这主要是由于营养物质和氧气的递送不足以及3D支架内代谢废物的去除。将细胞接种到3D支架的外表面可以使细胞获得足够的营养，但是位于支架内的细胞很可能发生坏死，从而阻碍骨再生。此外，在3D植入物中没有毛细血管网络的情况下，工程组织的*大厚度只能达到150-200 mm。尺寸大于此阈值可能会导致生物材料内部缺氧。骨膜通过内源性修复途径在骨形成和骨缺损愈合中起着不可或缺的作用。一些论文阐述了利用骨髓间充质干细胞（MSC）片或骨膜进行骨愈合的方法。研制一种能适应任何大小和形状骨缺损的仿生骨膜替代物是一种有前途的骨缺损修复方法。基于组织工程原理，在以往的研究中，我们开发了一种柔性细胞结构，作为成骨和血管生成的“骨膜”，一种自制的组织工程骨膜（TEP），它是通过将成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层（SIS）支架结合而成。在以前的研究中，它已成功用于重建长骨临界尺寸缺损（CSD）。在这项研究中，我们假设TEP可以修复兔子模型中较大的不规则骨缺损。

　　动物：46只新西兰白兔（NZWR）由36只成年兔（2月龄，约2.0千克）和10只新生兔（2周龄，约0.40千克）组成。细胞培养：简而言之，从新生儿NZWR（2周龄，约0.40 kg）的腹侧采集骨髓（5 mL））。从骨髓中分离的MSC，然后将其接种到装有10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的塑料培养瓶中，并在37°C和5％CO2下孵育。在显微镜下观察原代MSC。当MSCs达到80-90%融合时，用0.25%的胰蛋白酶分离，以2×106 L-1的密度转移到新的培养瓶中，，达到90%融合后再传代两次。

　　成骨诱导：第三代骨髓间充质干细胞在标准DMEM中进行成骨分化，DMEM中添加50 mg /L抗坏血酸、10 mmol /Lβ-甘油磷酸钠和10−8 mol/ L地塞米松，在37°C的5％CO2湿度培养箱中培养3周。通过改良Gomori染色法和茜素红染色法观察骨髓间充质干细胞的成骨分化。鉴定后，收集成骨诱导的MSCs作为接种细胞。

　　在屠宰后4小时内从健康猪采集的猪小肠，切成10厘米左右的长度。通过机械切除浆膜和肌层获得粘膜下层。用一系列化学脱细胞步骤处理剩余的粘膜下层，使用去污剂进行处理，冻干和灭菌。 *后，将所有样品在冻干机中于-70°C冷冻干燥，密封在密闭包装中，然后使用Co-60γ射线灭菌。将SIS剪成正方形（5××5 cm），并在紫外线下再次灭菌2 h，然后在接种细胞之前在含20％FBS的DMEM中浸泡1天。将骨诱导的骨髓间充质干细胞（2.0 × 109/L）的悬浮液缓慢滴入培养皿中的SIS方块上，并在37℃下孵育3小时。然后在每个复合物中加入适量的含10%FBS的DMEM，并继续培养7天。

　　扫描电子显微镜（SEM）：取培养15天的部分TEP进行扫描电镜观察。简单地说，样品在2.5%戊二醛中室温固定7天，然后在PBS中洗涤3次，每次15分钟，然后，将样品进行临界点干燥。

　　脱蛋白骨的制备：新鲜肩胛骨次全切除术切除新鲜肩胛体，在软组织切除后，在整个骨块中去蛋白。在每个块体上钻一排密集的垂直孔（每个孔直径为1.5 mm），以进行良好的脱蛋白。用H2O2、NaN3、NaOH、蛋白酶、甲醇/氯仿混合物、乙醚、乙二胺和无水乙醇处理骨块，制备DPB。样品在50°C的干燥箱中干燥，密封在密封包装中，然后使用Co-60γ射线灭菌。

　　不规则缺损骨的产生与治疗：用3%戊巴比妥溶液（40 mg/kg）腹腔麻醉36只NZWRs（2月龄，约2.0 kg）。对兔单侧肩进行去皮消毒。然后，直接分离暴露附着骨膜的肩胛体，切除除肩胛盂和部分肩胛颈、上、下角的肩胛体，建立肩胛骨次全切除模型。该模型的目的是保留肩肱关节的功能，为种植体的附着准备三角形的锚定点。取出切除后的骨块连同附着的骨膜。每只动物的肩胛骨造成单侧节段性不规则骨缺损后，将36只兔子随机分为三组（每组12只），分别用TEP（第1组）、同种异体DPB（第2组）或TEP–DPB混合物（第3组）进行治疗。在第1组中，将TEP散布在缺损区域，并修整边缘以适合骨缺损的大小和形状，然后用7-0显微外科缝合线将其缝合到三个准备好的骨锚定点，，这些锚定点预先钻有几个孔，以允许K线缝合穿过。在第2组中，用钢丝（直径0.5 mm）将同种异体DPB块固定到三个骨固定点。第3组，TEP包裹DPB。简而言之，将TEP包裹在DPB的表面，通过DPB的垂直孔用7-0显微外科缝线固定。然后用钢丝（直径0.5mm）将混合植入物（TEP-covered-DPB）固定在三个骨锚定点上。后用1-0尼龙缝合线逐层闭合切口。术前及术后第1天/第2天注射40万单位青霉素。每只动物手术侧的前肢和肩部用石膏固定4周。分别于术后4、8、12周每组处死3～4只兔，取整个肩胛骨（包括植入物）进行分析。

　　组织学评估：X线检查后，取实验部位肩胛骨中部组织作为标本。标本用4%中性缓冲福尔马林固定3天，用10%EDTA-2Na溶液在4℃下脱钙4周。然后将它们用一系列乙醇溶液脱水，并通过常规方法切成连续的石蜡切片。标本用HE以及Masson三色染色，以进行组织学分析。通过光学显微镜评价每个样品的所有切片。使用图像分析软件评估每个样本的所有切片。

　　甲醛墨汁灌注：在第12周时从第1组的四只兔子中随机选择一只兔子，进行墨汁灌注，以区别TEP介导的骨再生的血管形成。简而言之，通过腹腔注射3％戊巴比妥溶液（40 mg / kg体重）使兔子接受全身麻醉。随后，通过肌肉内注射1000 U / kg肝素来完成全身肝素化。切开腋窝区域的皮肤和皮下组织以暴露腋窝动脉和静脉。然后结扎腋动脉并向远端插管。腋静脉被切断，远端出血。从腋动脉远端注入大量的肝素-盐水（肝素12,500 U；生理盐水500 mL），直到从腋静脉流出的血被清除为止。将30%墨汁、10%甲醛、60%生理盐水混合的灌流液经插管注入腋动脉，直至腋静脉流出口变黑，皮肤、蹄变黑。结扎股腋窝静脉。处死家兔，切除肩胛骨，4℃保存24h，然后用甲醛（40 g / L）固定1周。对骨标本进行横向和纵向切片，用HE对玻片进行染色，以观察新形成的骨中微血管的形成。

　　结果：骨髓间充质干细胞的成骨分化：光镜下，原代MSCs呈三角形或多角形，第3代时呈均匀的长条状成纤维细胞样形态。经过骨融合诱导3周后，光镜下可见屈光性细胞内颗粒。通过茜素红染色进一步证实细胞倾向于聚集并形成钙化结节。改良Gomori染色显示在成骨诱导的MSCs中ALP表达增强。这些迹象表明诱导的MSCs成骨分化。

　　A原代骨髓间充质干细胞；B第3代骨髓间充质干细胞形态均匀；C成骨培养液诱导的融合MSCs可见细胞内屈光颗粒；D诱导3周后，MSCs融合形成钙化结节；E茜素红染色证实成骨诱导的MSCs形成钙化结节；F 改良Gomori染色法观察成骨分化MSCs的ALP表达。比例尺 = 100μm

　　SIS和SEM的特征：自制的SIS支架为白色柔性膜，厚度为100±20μm。DPB植入物被塑造成5± 2mm厚的不规则三角形，有多个孔。在培养皿中，TEP植入物保持了软组织的性质，大体呈膜状结构。HE染色显示TEP上有多个细胞。扫描电镜下，SIS由胶原纤维交织而成，在SIS上可见大量细胞附着在TEP上。

　　骨缺损的植入物。 A SIS的宏观表现；B 肩胛骨块衍生的DPB的宏观外观；C 培养的TEP的宏观外观；D 光镜下贴附于TEP上的接种细胞，HE染色可见（比例尺 = 100μm）； E 扫描电镜观察SIS；

　　术后动物行为：动物术后1h内迅速恢复，24h内可正常站立，1周内伤口闭合，切口无明显感染。大约两周后，就可自由活动。在整个实验过程中，所有动物均保持健康。没有任何动物感染或其他并发症。

　　用x线片分析骨缺损修复的进展情况，并在第4、8、12周与第1、2、3组进行平行比较。第1组术后4周骨缺损区可见低密度骨痂。第8周时，出现较多的骨痂。在第12周时，新形成的骨量和骨矿物质密度均大大增加。

　　X射线和宏观观察。*行（A–C）分别代表第1组4周、8周和12周肩胛骨缺损修复的X光片。第2行（D-F）分别为第2组4、8和12周肩胛骨缺损修复的X线片。第3行（A-C）分别为第3组4、8和12周肩胛骨缺损修复的X线片。第4栏（J–L）分别代表第1组、第2组和第3组在12周时肩胛骨缺损修复的宏观视图。

　　组织学发现：从肩胛骨区切取的样本在宏观上非常相似，在12周时形成近似肩胛骨的形状。光镜下，HE染色各组4周时可见轻度单核细胞浸润。

　　在光学显微镜下用HE（第1、3和5行）和Masson三色（第2、4和6行）染色进行组织学检查。在第1组（第1行，第2行）中，TEP在第4周形成了岛状骨痂（A，B）。新生骨组织增加，血管不规则或骨髓腔未成熟，而TEP在8周时消失（可能降解）（C，D）。第12周时，新生骨全部发育成成熟松质骨（E，F）。第2组（第3、4行），第4周（G，H）DPB主要被瘢痕组织和浸润淋巴细胞包围，第8周（I，J）或12周（K，L）伴有少量新骨组织形成。在第3组（第5、6行）中，TEP和DPB之间有少量的新骨形成，这些骨在4周时伴随疤痕组织降解（M，N）。新的骨组织在第8周（O，P）形成编织骨，而在第12周则倾向于形成成骨细胞嵌入矿物基质的成熟层状骨（Q，R）。三角形代表TEP，黑色箭头代表新形成的骨组织，白色箭头代表DPB的残留物。比例尺= 1 mm。

　　TEP介导骨再生的血管化作用：腋动脉灌注甲醛墨汁后，整个骨块变黑。肉眼可见骨块表面可见小血管和网状吻合。

　　甲醛墨汁灌注。A 腋动脉灌注手术黑箭头指向腋动脉；B 墨汁灌注后骨块的宏观外观。C 黑色微血管，填充有黑色墨水，在纵向区域中可见条纹，在横截面中则为圆形圆点。D“#”代表墨水填充的微血管；比例尺 = 1mm

　　在这项研究中，有几个局限性需要进一步研究。首先，我们没有测试TEP和TEP/DPB混合物的力学性能和降解曲线。第二，还没有计算TEP的接种效率或细胞密度，这可能会影响TEP制造的标准化。第三，除SIS植入组（阴性对照组）外，可能有必要设计一个假手术组对骨缺损不进行任何治疗，以更清楚地确认TEP在体内的成骨潜力。