基因组编辑系统CRISPR 中国实验动物信息网 2020-10-21 526

　　为了敲除斑马鱼胚胎中的基因，哈佛大学的发育生物学家Alexander Sie使用了基因组编辑系统CRISPR。然而，席尔*终剔除了一个或多个基因。他和他的同事们设计了一种标记和追踪发育中动物细胞的新方法。研究结果在线发表在26日的《科学》杂志上。研究人员揭示了使用CRISPR诱导的突变的令人惊讶的发现。成年斑马鱼的许多组织和器官都由一小部分胚胎细胞组成。

　　一些研究人员开始使用这种方法来研究发育过程。伦敦Kerrick研究所的发育生物学家James Brisco称这种方法为“ CRISPR技术的创新应用”。 “这项技术有助于重建构成动物身体的所有细胞的“家谱”。 “一些科学家计划使用这种方法来追踪肿瘤的进展。一些人使用CRISPR来记录细胞历史，包括细胞对环境的影响。

　　GESTALT的新技术：建立动物体内所有细胞的“家谱”

　　Schier和他的同事是哈佛大学的遗传学家George Church。我们使用了CRISPR的“基因组破坏”功能。在正常的CRISPR编辑中，一种称为引导RNA的分子将Cas9酶引导至基因组中的特定位点，在该位点切割双链DNA。模板DNA可以指导细胞修复双链断裂，编辑准确性可以达到单核苷酸变化的水平。但是，如果科学家不提供模板链，则细胞将无法准确修复断裂，*终该基因将形成“疤痕”，从而可能发生核苷酸丢失或插入。为了确保真正剔除

　　目标斑马鱼基因，Schier引入了几种不同的引导RNA来靶向该基因中的多个位点。但是，某些重复实验的结果却大不相同。缺失的大小不同，您会在基因的疤痕区域看到大小不同的插入物。华盛顿大学的遗传学家Schier和Jay Shendure已经意识到可以进一步利用这种遗传破坏的多样性。 Schier和Shendure已将一组包含10个CRISPR靶向序列的外源DNA插入斑马鱼胚胎的基因组中。接着，将Cas9酶和对应于靶序列的10个指导RNA注射到单细胞胚胎中。随着胚胎的发育，每个细胞中的CRISPR系统会多次破坏目标DNA并用条形码标记（使用独特的缺失或插入）。拆分单元格时，子单元格首先具有相同的条形码标签，并在进行不同更改之前被Cas9在不同位置切割。条形码的*个更改应发生在两个单元的阶段。约4个小时后，编辑工具会慢慢关闭。此时，胚胎包含数千个细胞。然后遵循其余的条形码。这些细胞的持续增殖发生在成年动物中。四个月后，科学家收集了成年斑马鱼器官，并从大约200,000个细胞中分离出1,000多种不同的条形码。具有相似条形码的细胞很可能在以后的发育中分裂并形成，因此科学家可以使用计算机程序来计算这200,000个细胞的家族树。换句话说，您可以使用谱系图来找出每个单元格的来源。

　　*令人惊奇的发现之一是，所有器官中的许多组织都是由少量细胞产生的。在大多数器官中，超过一半的细胞共享少于七个条形码。在除大脑以外的所有器官中，有25种不同的条形码构成了90％以上的细胞。布里斯科说：“组成组织的细胞数量可能比我预期的要少。”的。同样，一些癌症研究中，例如产生肿瘤的前体细胞数量，肿瘤中的细胞之间如何关联，扩散的癌细胞与原始肿瘤之间如何关联等。它还有助于阐明有关的重要问题。

　　Schier说，这项技术也有一些缺点。例如，并非所有新一代细胞都可以可靠地标记。但是，与跟踪细胞及其后代的其他方法（例如染色方法和对自发突变的依赖性）相比，使用CRSIPR生成的条形码标记进行后续分析更为有效和有用。这简单。波士顿儿童医院干细胞计划主任伦纳德·佐恩说： “这种标记细胞的方法比现有方法更容易，因此我认为癌症生物学家将开始考虑使用这种方法来研究癌症。当然，请尝试一下。” 另一个mSCRIBE系统：记录细胞所经历的环境效应

　　研究人员提出了将CRISPR转变为细胞记忆类型的其他方法。她说：“从概念上讲，这是*令人兴奋的事情。历史可以记录在DNA中。”麻省理工学院的研究小组已经在进行这项研究。上周，Timothy Lu和他的同事们在预印本网站bioRxiv.org上上传了一篇文章。本文介绍了一种称为mSCRIBE（哺乳动物合成细胞记录仪集成生物事件）的系统。研究人员没有添加包含10个CRSIPR靶向序列的条形码，而是将单个CRISPR靶向序列插入细胞中并修饰了该位点以编码指导RNA。*终，系统以自身为目标。引导RNA将Cas9引导至其来源DNA，该DNA破坏DNA，导致序列突变，并*终产生包含突变的引导RNA。突变的引导RNA进一步将Cas9引导至修饰的靶序列，此后该过程继续循环，在此期间DNA序列和引导RNA也继续变化。通过研究

　　CRISPR靶序列在数千个单细胞中的变化，研究人员估计Cas9需要运行几轮才能产生特定序列。 （此过程类似于交流游戏中需要的回合数）将*个短语“龙虾煮”转换为“输家”。在下一个实验中，我们将Cas9靶向基因的活性与细胞内炎症途径的活性相结合。在暴露于更多炎症因子TNFα的细胞中，在靶序列中记录了更多轮的Cas9突变。

　　然后他们在小鼠中测试了CRISPR记录工具，将修饰的细胞注射到动物体内，并将促炎分子注射到一些细胞中。与未治疗的小鼠相比，在注射了这些分子的小鼠中，CRIPR靶向序列发生了显着变化。作者写道，该方法可应用于体内以模拟方式记录生理相关的生物信号。 Lu和他的同事建议，这种方法还可以记录肿瘤微环境中癌细胞的刺激情况，并在疾病发展过程中追踪细胞内特定途径的活性。 丘奇说，这种方法对大脑研究也非常有用，例如记录基本记忆所涉及的通路的活动。 “此方法可用于将临时过程转变为永久记录，并将其呈现给大脑中的所有神经元细胞。”