转基因小鼠 中国实验动物信息网 2020-10-14 476

　　（1）供体小鼠的选择，过度排卵和繁殖应根据构建转基因动物的目的确定供体小鼠的种类和谱系选择。要创建动物模型，通常具有明确的遗传背景，高度的同质性（即，谱系中每个身体的遗传同一性的程度）和同质性（所有基因位点的每个身体的同质性）。具有更科学特性和排卵数的菌株），并选择优质的胚胎。例如，C57BL，Paramouth等。通常，将5-6周大，18-22 g，健康，性成熟的SPF级雌性小鼠用作供体。根据实验规模确定供体数量。

　　选择供体后，在白天从早上6点至下午6点以及晚上从下午6点至下午6点调整动物室的照明。通过尾静脉或腹膜内（通常13：00-14：00）注入PMSG5-10IU，46-48小时后注入HCGj-10IU。注射HCG后，将正常雄性小鼠（1：1）放在笼子里，并在第二天清晨确认坐姿。具有阴道坐姿的一只是受精卵供体小鼠。

　　（2）选择受体小鼠和制备假怀孕的雌性小鼠。受体小鼠通常选择与供体相同的品系。但是，与代孕雌性小鼠一样，也可以使用其他具有强生育力和良好母性的品系。通常，将体重超过25 g且年龄7-8周的健康雌性小鼠用作受体。要准备

　　假怀孕雌性小鼠，请先获得结扎的雄性小鼠。将6-8周大的雄性大鼠麻醉，并进行腹部手术。结扎，缝合和休息至少两个星期的两侧切口。在圈养供体小鼠的同一天，将受体雌性小鼠与结扎的雄性小鼠（1：1）一起笼养。在第二天，检查阴道座，并且是具有阴道座的假怀孕雌性小鼠。

　　（3）获得受精卵在用阴道囊检测供体小鼠的下午收集前核胚胎。将供体小鼠断头，在无菌环境中切开Faropius管，放入200μlM2液滴中，在固体显微镜下用安瓿刺穿，轻轻挤压涂有o石细胞，300μg/ mI透明质酸酶的受精卵用M2溶液消化。肉芽肿细胞脱落后，将受精卵用M2小滴清洗3次。在此过程中，检查了受精卵的质量，并消除了未受精卵和其他异常卵。将正常卵转移至M16溶液中，并置于37°C和5％CO2的培养箱中。

　　（4）基因注入一个微型操纵器。倒置显微镜必须具有相位差系统或差分干涉差系统。鸡蛋固定针安装在左侧，注射针安装在右侧，以调节镜头和焦点的长度。将一滴眼用培养液放在凹面玻片的中央，转移10到20个受精卵，并盖上矿物油。在微操纵器下，用固定针吸出受精卵，将含有DNA的注射针插入受精卵的雄性原核，并注入DNA溶液（约2 pL，含有约500-600个基因拷贝）。 ..在看到男性前核稍有扩张后，他立即将其从针头中拔出。一些数据认为注射两个原核可以提高整合率，因此可以以相同方式注射女性原核。注入所有受精卵后，将它们置于包含80μlM16培养基的另一个液滴中，并置于17°C的5％CO2恒温箱中。

　　（5）移植的假受孕小鼠使用戊巴比妥钠，剂量为100 ms/kg体重，通过尾静脉注射或Smianxin II麻醉（每只稀释10只，每只0.2毫升）麻醉。 ））通过腹膜内注射脱发，在新部分切开一个0.5厘米的小开口，避开血管，并引出Faropius管和卵巢。在固态显微镜下，转移针吸取注入了M2溶液中20-30 DNA的受精卵，然后插入输卵管的原纤维，将受精卵转移至输卵管的ampla。然后将Faropius管和卵巢放回假孕小鼠，进行缝合和消毒。整个过程应尽快完成，以减少暴露于鸡蛋的负面影响。完成后，将受体小鼠送入风险笼以加强管理和观察。

　　Bubble 3是为了防止在未将卵移植针插入移植部位时卵掉落，而Bubble 2和Bubble 1是为了确保所有卵都移动到ampla。它是。

　　（6）整合和表达检测

　　受体小鼠出生后，将后代的尾巴切掉并提取DNA。首*行PCR检测，然后与PCR阳性样品进行Southern杂交以确认转基因小鼠。根据表达的蛋白质类型，使用放射免疫分析，荧光免疫分析，ELASA，Weathern印迹和其他技术检测转基因小鼠的表达。某些人需要测试相应的功能。