细胞核移植 中国实验动物信息网 2020-10-14 480

　　（1）改良的NCSU-23培养液

　　CSU-23培养液是不含NaHCO 3的磷酸盐缓冲液，生理pH磷酸盐缓冲液由摩尔比为3：1的磷酸二氢根阴离子和磷酸二氢根阴离子组成。这些离子交换导致Na +和K +浓度不断变化，从而可以调节NaCl和KCl浓度以保持渗透压和Na +/K +比率。

　　（2）供体母猪排卵过多，卵母细胞和受精卵的收集

　　对于体重125至145 kg的杂种幼母猪，将18至20 mg的豆腐与饲料均匀混合并同时发芽。我会。根据性周期的持续时间，给母猪喂食5-14天，并在进行女同性恋治疗的*后一天肌肉注射250μg的雌激素（Bayer）。*后一次喂食豆科动物后的15到17个小时，肌肉注射1500 IU的PMSG，以诱导母猪超排卵。注射PMSG 82小时后，肌肉注射1000 IU HCG。注射HCG后46-54小时，用含4 g/L牛胎血清的Dalbecco磷酸盐缓冲液向后冲洗输卵管，并预热以收集卵母细胞。注射HCG后24至36小时，通过人工播种或自然交配收集受精卵。注射HCG后52-54小时，用含4 g/L牛胎儿血清的PBS清洗卵。

　　（3）注射HCG后28-51小时分离和培养猪颗粒细胞通过抽吸2-8mm高卵巢杂交母猪的卵泡液并离心10分钟收集颗粒细胞。 DMEM（10％牛胎血清，0.01 mM非必需氨基酸，2g/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），6μl/ ml庆大霉素）继续生长数天，然后冷冻保存。在进行核移植之前，将（1-5）x 104个颗粒细胞放入每个35 mm培养皿中，该培养皿中含有0.1 mM非必需氨基酸，2g/ml bFGIF和10％牛血清的DMEM溶液。 混合文化完成合并。将这些细胞在血清饥饿的情况下在含有0.59％牛胎儿血清的DMEM中培养48-72小时。然后将其用膜蛋白酶消化并收集，放置在改良的NCSU-23磷酸盐培养基中，然后用作核供体，悬浮并在38.5°C下保存20-120分钟。

　　（4）卵母细胞的激活

　　将卵细胞置于激活介质中，并以1.0 kV/cm的DC进行刺激。每5秒电击为60μs，总共2次电击。活化介质是D-山梨糖醇溶液，其中含有0.1 mM DDL4、0.05 mM CaCl2和0.3 M.

　　（5）首*行核移植胚胎重建

　　将收集的卵细胞用含4 g/LBSA（38°C）的PBS洗涤几次，然后在38°C移植到不含钙的NCSU-23磷酸盐缓冲液中。做到了。将液体送回实验室。为了除去细胞核，用直径18mm的玻璃针吸出*极下方的少量细胞质，并将吸出的细胞核暴露于紫外线下以确认中期板的存在。在脱钙的磷酸盐缓冲液NCSU-23中将卵细胞在38°C下培养20分钟，该磷酸盐缓冲液包含5 pg/ml细胞角蛋白B和7.5μg/ ml Hoechet-33342、每个肉芽肿细胞都放在每个去核卵母细胞的带状疱疹下。将该嵌合体转移至融合装置。融合介质是700μl的去离子水，其中包含0.3M甘露醇，0.1mM DDL4和0.1mM CaCl2、渗透压为280mosm。用5V AC电击5分钟后，两次（60μs“）进行1.5kV/cM DC电击，以融合并激活细胞。使用的设备是ECM2001电刺激细胞操纵器。 （BTXIncSan-Diego）：用二元碳酸盐溶液NCSU-23洗涤嵌合体数次，并在含有5％CO 2的38.5℃的潮湿气氛中培养0.5至1小时，并将融合的嵌合体扩增300倍。在倒置显微镜下观察，用1.2 kV/cM DC再次刺激细胞，并连续两次电击，每次电击60μs，处理后，将它们在NSCU-23培养基中培养过夜。

　　（6）第二次胚胎移植的重建将受精卵用Biofuge-13离心机在14900g下离心15分钟，并在含有5.0μg/ ml细胞角蛋白B的磷酸盐缓冲液NCSU-23中离心38°。放入C中20分钟，使用受精卵和2个原核，25.？一个35μm的玻璃管吸住包含2个原核的膜，并连接到膜上。取出（如果第二个极体被排泄，也将其取出）从那天起，*次假核移植就开始制备含有假核的核体。除使用45μm的去核玻璃针外，其余与除核方法相同，将单个核置于单个去核受精卵的卵圆周间隙中，交流电5V使用5秒钟后，然后是1.2 2 kV/cM直流电，每次60μs，然后将融合嵌合体用NSCU-23缓冲液在38°C下洗涤几次，并在潮湿的环境中（含5％CO2）孵育30-60分钟。

　　（7）母猪接受治疗PMSG和HCG可以联合使用以维持妊娠。在第10天，肌内注射3至3.5天，注射10,000 IU PMSG，然后在发情周期的第13天，肌内注射HCG。