慢性间歇低氧动物模型 中国实验动物信息网 2020-10-13 524

　　【摘要 】 目的 建立慢性间歇低氧幼鼠模型 ,研究其空间学习记忆能力和海马 CA1区神经元超微结构的变化 。方法 八臂迷宫训练成功的 3～4周龄 SD 幼鼠 40只随机分 2 周间歇低氧组 ( 2H ) 、对照组(2C)和 4周间歇低氧组 (4H) 、对照组 ( 4C) ,建立慢性间歇低氧动物模型 ,间歇低氧结束后八臂迷宫测试

　　学习记忆能力 ,透射电镜观察海马 CA1 区神经元的超微结构变化 。结果 间歇低氧组参考记忆错误[ (3. 30 ± 1. 06)次 、 (2. 00 ± 0. 67)次 ]、工作记忆错误 [ (2. 30 ± 0. 67)次 、 ( 1. 00 ± 0. 82)次 ]和总错误次数

　　[ (5. 40 ± 1. 78)次 、 (3.00 ± 0. 82)次 ]均高于对照组 (P<0.05) ,且随着间歇低氧时间的延长 ,这种错误次数增多 ( P < 0. 05) ;电镜下间歇低氧组海马 CA1区神经细胞的形态 、胞浆内的细胞器均有明显变化 。 结论

　　慢性间歇低氧可引起幼鼠空间学习记忆能力下降 ,这可能和海马CA1区神经元超微结构改变有关 。

　　阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征( obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS)是儿童的常见病之一 ,发病率在 1% ～10%左右。 OSAHS对儿童全身各系统都有很大的影响 ,特别是神经系统 , OSAHS对其造成的损害可以导致儿童出现学习和记忆功能障碍,但是 OSAHS引起学习记忆功能损害的病理生理机制尚不完全明确 。 因此 ,若能模拟 OSAHS的病理生理过程和脑学习记忆功能损害 ,从细胞分子水平阐明其发病机制 ,将为 OSAHS患儿学习记忆功能损害的防治提供理论基础 。 本实验根据 OSAHS患儿睡眠时慢性间歇低氧的病理生理特征建立慢性间歇低氧幼鼠模型并对其心血管系统的生理指标进行评价,用八臂迷宫试验测定其空间记忆 ,研究 OSAHS与学习记忆的关系和作用机制 。

　　材料与方法

　　一、材料

　　取体质量为 80～100 g健康雄性 SPF级 SD ( Sp ra2gue Dawley)幼鼠 (3～4周龄 ) 50只 ,由温州医学院试验动物中心提供 ,合格证号 : [ SYXK (浙 ) 200520061 ];CYES2Ⅱ 型氧、二氧化碳气体测定仪 (上海嘉定学联仪表厂 ) ; POW ERLAB /8SP生理信号采集分析系统 (澳大利亚 AD Instruments公司 ) ;间歇低氧大鼠不锈钢饲养舱和空气模拟对照舱自制 ;空气压缩泵 ;电磁阀 ;单片机 ;医用压缩氧气 (浓度 > 99. 5% )和压缩高纯度氮气 (浓 度 > 99. 99% ) , 由 温 州 市 医 用 氧 厂 提 供 ;LKB2088型超薄切片机 ; H27500型透射电镜 ;八臂迷宫 (由上海欣软信息科技有限公司提供 ) ;迷宫用饲饵 (浙江大学医学院脑与智能研究中心 ) 。

　　二、方法

　　1. 八臂迷宫试验 :本实验参照 Zou LB 等方法进行训练 。训练前先将幼鼠饿至原体重的 85%左右 ,此后在训练过程中保持该体重。 然后迷宫中适应 2 d,

　　每天 1次 。 适应时 2只幼鼠同时置于迷宫中 ,自由活动和摄取饵 15m in。适应后进行 2次/d的训练。 每次训练中 ,八臂中只有四臂放置了饵 (分别是 3, 5, 6, 8号臂 ) ,整个实验过程均维持此顺序 。幼鼠放在迷宫中央区 ,用一小塑料桶盖住, 15s后提起塑料桶放出幼鼠 ,幼鼠可选择进入任意一臂 ,以摄取饵。 幼鼠进入有饵的臂且摄取了饵为一次正确选择 ,否则为错误选择 。

　　重新进入放饵臂称为工作记忆错误 (working memoryerror,WME) ,*次进入不放饵臂称为参考记忆错误( reference memory error, RME) ,两者之和为总记忆错误 ( totalmemory error, TE) 。 连续 5次训练错误选择次数为 ≤1次 ,同时 WME必须为零 ,认为训练成功。

　　2.分组 :取迷宫训练成功幼鼠40只 ,随机分为2周低氧组 (2H) 、4周低氧组 ( 4H ) 、2周对照组 ( 2C) 、4周对照组 (4C) ,每组各 10只。

　　3. 动物模 型 建 立 : OSAHS动物模型建立参照McGuire M、 Gozal D等方法加以改进 :气体钢瓶 、减压阀、流量计、控制程序、继电器 、电磁阀、显示器等组成控制系统 , 自制间歇低氧舱主体由不锈钢制成 ,125 cm *48 cm * 24 cm大小 ,舱盖中间部分为玻璃 ,方便观察 ;侧壁上有 4个进气的单向阀 , 4个排气的单向阀 ,这样舱内压力可以始终保持常压。 实验过程中内置 4个鼠笼 ,下铺 4个铺满草纸的托盘接排泄物 ,幼鼠自由活动 ,不限饮食。

　　不同气源有不同的通气管道 ,均由程序控制的电磁阀开关 ,以 0. 3 KP压力通氮气 30 s,停 30 s, 25L /m in流量通氧气 12 s,停 18 s,此为一个循环。 每天 7. 5 h(8: 50～16: 20) 。 在停止通气阶段由连接的测氧仪分别测间歇低氧舱内的氧浓度高值、低值和二氧化碳浓度 ,舱内氧浓度变化曲线示意图见图 1。 对照组置于同等条件下的空气模拟对照舱 ,通压缩空气 ,同一单片机程序控制 。

　　实验过程中 ,各舱上面均盖厚布 ,使舱内保持黑暗 ,模拟夜间睡眠状态 ,每天出舱后幼鼠置于日光灯下 ,模拟白天 ,活动、饮食不限。 试验结束前使幼鼠保持饥饿状态 ,低氧结束当日测试迷宫 ,整个测定过程参照物体和放食物臂同训练过程一致 。

　　4.动物处理 : 低氧结束次日 , 戊巴 比妥钠 ( 35mg/kg- 1 bw, ip ) 麻醉 , 右心导管法测量肺动脉压力,生理记录仪记录肺动脉压力波 ,计算肺动脉平均压 (mPAP) ,左颈总动脉插管测颈动脉压 (mCAP)后 ,每组随机取 1只幼鼠 ,仰卧固定 ,剖开胸腔 ,暴露心脏 ,将吸有预冷至 0 ～4 ℃生理盐水的针管刺入左心室 , 剖开右心耳排液 ,快速灌入 100m l左右的生理盐水 , 再用 200mL 左右预冷为 0～4 ℃的 4%戊二醛缓慢灌注后迅速取脑 ,以常规电镜程序制作标本 , 2. 5%戊二 醛 前 固 定 , 1% 锇 酸 后 固 定 , Epon812 包 埋 ,LKB2088 型 超 薄 切 片 机 切 片 , 经 铅 2 铀 双 重 染 色 ,H27500型透射电镜观察。 各幼鼠剪去右心房组织 ,沿室间隔边缘剪下右心室 ,分别称取右心室游离壁 (RV)和左心室加室间隔 (LV + S)的重量 ,并计算 RV / (LV+ S)的重量比 ,作为右室肥大的指标 。

　　5. 统计学方法 :数据用 x ±s表示 ,统计学处理采用 SPSS12. 0统计软件。 多组间比较如正态分布、方差齐性 ,采用单因素方差分析和 LSD2 t检验 ,方差不齐则采用 Tamhane’ sT2检验。

　　结果

　　一、肺动脉压 、颈动脉压和右心室重量比的变化

　　表 1显示 , 2H 组大鼠 mPAP较 2C组高 18. 72%( P < 0. 05) , 4H 组大鼠 mPAP较 4C组高 16. 87% ( P< 0. 05) 。 两低氧组之间 、两对照组之间 mPAP差异均无显著性 ( P > 0. 05) 。 各组之间 mCAP、RV /LV + S差异均无显著性 ( P>0.05) 。

　　二、八臂迷宫测试结果

　　表 2显示 , 2H组 RME、WME和 TE均高于 2C组 (P<0.05) ; 4H组 RME、WME和 TE均高于 4C组 (P<0.05) ; 4H 组 RME、WME 和 TE 均高于 2H 组 (P<0.05) p="">0.05) 。

　　三、海马CA1区超微结构观察

　　2C与 4C组具有正常的神经元 、线粒体、突触、有髓神经纤维 ,核膜清晰 。 2H组神经细胞核膜变模糊 、深染、轻度固缩 ,线粒体轻度空泡变。 4H(图 3A、B )组神经细胞核膜明显模糊、边界不清 ,染色质颜色变深 ,线粒体嵴轻度扩张 ,广泛存在局灶性髓鞘松解。

　　讨 论

　　在儿童中 ,未经治疗的 OSAHS可以引起很多并发症 ,比如生长延迟、精神发育迟缓、高血压、肺动脉高压、右心衰以及学习记忆障碍等。 OSAHS与儿童学习记忆障碍的关系近年来在国内外逐渐受到广泛关注 ,但对其研究甚少 , OSAHS的主要病理生理过程是夜间睡眠时上气道塌陷引起反复的低氧 - 复氧循环以及睡眠结构的紊乱。 有人认为夜间慢性间歇低氧血症引起神经系统的损害可能是导致 OSAHS患儿学习记忆功能损害的重要机制,所以 ,我们模拟其病理生理过程 ,制作慢性间歇低氧幼鼠模型来进行研究。

　　实验中 ,我们对模型的心血管系统的生理指标进行了评价 ,发现 2周和 4周间歇低氧组大鼠均出现了肺动脉压升高 ,与国内外类似模型相符 ,间接证明本模型造模成功 。

　　放射状八臂迷宫 (四臂放食物 )是一种经典的测定动物空间记忆的方法 , 它可以同时检测动物的参照记忆和工作记忆 ,动物通过观察周围固定的参照物来学习和记忆自身与饵 (置于迷宫臂末端的白色小食丸 ) 的相对位置。 在本实验条件下 , 2H和 4H 组的幼鼠在放射状八臂迷宫的错误选择次数 (包括 RME、WME和 TE)分别高于 2C和 4C组 ,证实间歇低氧能够造成幼鼠空间学习记忆能力 (包括工作记忆和参考记忆 )的损害 。 此外 ,本实验还显示 4H 组 RME、WME和 TE要高于 2H组 ,而 4C与 2C组之间差异无统计学意义 ,说明这种空间学习记忆能力障碍随着间歇低氧时间的延长而加重。

　　海马是公认的与空间学习记忆密切相关的脑区 ,海马 CA1区对缺氧缺血特别敏感 ,而通过抑制海马神经元细胞调亡可以改善缺氧缺血所致的学习记忆障碍 。 本实验利用电镜对实验幼鼠海马 CA1区进行观察发现 ,相对于对照组 , 2H 组与 4H 组海马均出现了明显的超微结构改变 ,而且这种改变 4H 组要明显的多 ,存在早期凋亡现象 。 这种超微结构上的变化 ,通过影响神经元的能量代谢等正常生理活动 , 使得幼鼠的海马突触可塑性受到影响 ,而这种可塑性是学习记忆的神经基础;此外 ,由于反复的低氧 - 复氧导致了氧化应激 ,使得 ROS的过量生成 ,参与神经细胞凋亡。 因此 ,我们推测慢性间歇低氧引起幼鼠空间学习记忆障碍的机制可能和氧化应激引起海马CA1区受损、神经元早期凋亡有关 ,其他的分子生物学机制尚待进一步深入研究 。

　　本实验利用慢性间歇低氧幼鼠模型对 OSAHS导致儿童学习记忆功能障碍这一临床现象进行了验证 ,并通过对海马超微结构的观察从病理学角度初步解释了人类 OSAHS致学习记忆障碍的可能机制 ,提示我们早期即有效治疗儿童 OSAHS的重要性以及通过对神经细胞凋亡进行干预和调控将可能成为 OSAHS治疗的一个新途径。