RNA疫苗,CAR-T细胞 中国实验动物信息网 2020-09-30 413

　　表达嵌合抗原受体（CAR）的基因修饰的T细胞（CAR-T）用于过继T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤中已获得临床成功。但是，在实体瘤患者中，CAR-T细胞疗法面临挑战，效果不是很好。重要的疾病是有限数量的癌症特异性高表达和低肿瘤/靶向毒性（肿瘤外/靶向毒性）细胞表面靶标，可有效根除肿瘤。

　　科学家*近报道了与癌症有关的cludin6（CLDN6）的表达。 CLDN6是一种4跨膜蛋白，参与紧密连接的形成。在一项新的研究中，生物制药新技术公司（BioNTech）的研究人员分析了一整套人和小鼠组织，以评估CLDN6是否可用作CAR-T细胞治疗的靶标。那个表情。分析结果表明，在人类中，胎儿胃，肺和肾组织中的CLDN6转录水平较高，但在正常的成人组织样品中则没有。此外，与先前的水平一致，CLDN6转录水平在各种人类癌症中普遍升高，包括睾丸癌，卵巢癌，宫颈腺癌和肺腺癌。在小鼠中，CLDN6在胎儿器官中广泛表达，但在大多数成年小鼠器官中不表达，因为它在分娩前被下调。从严格意义上讲，这表明CLDN6是癌胚细胞表面抗原，并且具有适合CAR-T细胞靶向的理想表达谱。

　　这些研究人员使用4-1BB共刺激域（即识别并结合CLDN6的CAR）设计了CLDN6-CAR。对于该受体域，他们设计了对纳摩尔范围CLDN6具有高特异性和结合亲和力的单链可变片段（scFv）。他们发现，经过基因修饰后，表达CLDN6-CAR的T细胞（CLDN6-CAR-T细胞）能够敏感地识别并杀死转染了CLDN6NA的CLDN6阴性人类肺癌细胞COLO699N。 ..另外，CLDN6-CAR-T细胞只能杀死被CLDN6NA转染的COLO699N细胞，但是可以被CLDN3、CLDN4或CLDN9NA转染的COLO699N细胞杀伤，后者与CLDN6具有更高的氨基酸同源性。你不能杀死细胞。当将CLDN6-CAR-T细胞与CLDN6阳性的人类肿瘤细胞系共培养时，观察到干扰素γ（IFNγ）的分泌和T细胞活化标志物的上调，但是CLDN6阴性的肿瘤细胞。与之共培养时，不会发生这种情况。 CLDN6-CAR-T细胞还可以有效消除CLDN6阳性的PA-1卵巢癌球体。 CRISPR/Cas9敲除CLDN6可完全禁用CLDN6-CAR-T细胞对PA-1卵巢癌球体的识别。这进一步证实了CLDN6-CAR-T细胞的高效率和靶标特异性。接下来，这些研究人员研究了CLDN6-CAR-T细胞在人肿瘤细胞系异种皮下移植的NSG小鼠中的抗肿瘤活性。这些小鼠接受了单剂量的人CLDN6-CAR-T细胞或对照细胞移植。与患有快速进展疾病的对照小鼠相比，所有用CLDN6-CAR-T细胞治疗的小鼠在2周内都经历了肿瘤的完全消退。注射后25天内，可以在治疗的小鼠中检测到循环中的CLDN6-CAR-T细胞。为了评估此方法的广泛应用，这些研究人员选择了CLDN 18.2、它与CLDN 6的关系相对较远。 CLDN18.2在具有高度医疗需求的各种肿瘤中表达（例如胃食管癌和胰腺癌）。在人和小鼠中，其在正常组织中的表达仅限于胃粘膜中分化细胞的紧密连接。他们用CLDN18.2特定的scFv替换CLDN6特定的scFv，以构建表达CLDN18.2-CAR和CLDN18.2-CAR的CAR-T细胞（称为CLDN18.2-CAR-T）。

　　CLDN18.2-CAR-T细胞表现出与CLDN6-CAR-T细胞相似的功能特性。移植的CAR-T细胞在体内的定植和持久性是其临床功效的关键。但是，在实体瘤的情况下，CAR-T细胞很难到达肿瘤细胞，并且在免疫抑制性肿瘤微环境中，CAR-T细胞与靶细胞接触时缺乏生长信号，因此CAR-T细胞由T细胞引起。这个百分比正在迅速下降。近年来，这些研究人员已使用脂质体（编码脂质体抗原的RNA，RNA-LPX）进行静脉注射，该脂质体携带编码抗原的RNA在癌症患者的天然细胞库中产生肿瘤相关的T细胞。我很兴奋。这种纳米级疫苗将抗原递送到脾脏，淋巴结和骨髓中的抗原呈递细胞（APC），同时启动依赖于高像受体（TLR）的I型IFN驱动的免疫激活程序。促进抗原特异性T。细胞活化并强烈增殖。这些研究人员进行了一系列实验，以验证这种改进的方法是否可以用作增强CAR-T细胞的RNA疫苗（CAR-T细胞扩增的RNA疫苗，称为CARVac）。首先，他们测试了CLDN6是否出现在树突状细胞的表面上并在体外刺激CLDN6-CAR-T细胞。他们检测了用各种剂量编码CLDN6的RNA-LPX（简称CLDN6-LPX）处理过的树突状细胞表面上CLDN6的剂量依赖性表达。树突状细胞表面上获得的CLDN6的表达诱导与树突状细胞共培养的CLDN6-CAR-T细胞的激活，细胞因子分泌和增殖，呈剂量依赖性。向BALB/c小鼠静脉注射CLDN6-LPX后，可以在脾树突状细胞和巨噬细胞表面检测到CLDN6表达，而在淋巴细胞表面检测不到。这证实了CLDN6在体内是独特的。递送至抗原呈递细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）。随着抗原呈递细胞的成熟，在静脉注射CLDN6-LPX的小鼠的脾脏和淋巴结中检测到了天然杀伤细胞（NK细胞），B细胞和T细胞的强烈激活。接下来，将C57BL/6小鼠移植有用细胞增殖染料标记的CLDN6-CAR-T细胞，并接种CLDN6-LPX或对照RNA-LPX。与对照RNA-LPX疫苗接种的小鼠相比，CLDN6-LPX疫苗接种的小鼠所有主要身体部位的脾脏和淋巴结都有一定比例的CLDN6-CAR-T细胞增殖。它显示了显着的增长。这表明CLDN6抗原在淋巴室中。使用各种函数表达式。为了评估CARVac策略在体内的性能，这些研究人员允许接受全身照射的小鼠进行CLDN6-CAR-T细胞移植。他们发现单剂量的CLDN6-LPX可能引起循环中的CLDN6-CAR-T细胞大量增殖。这种增长与CLDN6-LPX的剂量水平有关。 CLDN6-LPX接种后3-4天，CLDN6-CAR-T细胞的比例达到峰值，然后下降。在另一个实验中，从每只小鼠1,000个CLDN6-CAR-T细胞和CLDN6-CAR-开始，向多组小鼠注射不同剂量水平的CLDN6-CAR-T细胞。 .. T细胞移植后立即接种或不接种CLDN6-LPX。在未接种CLDN6-LPX的小鼠中，主要CLDN6-CAR-T细胞的定殖与注射细胞的数量成线性关系，并随时间推移保持稳定或缓慢。和下降。值得注意的是，CLDN6-LPX疫苗接种的小鼠中会增殖CLDN6-CAR-T细胞，这种增殖与注射的初始细胞剂量无关。由CLDN6-LPX介导的1000个CLDN6-CAR-T细胞的增殖导致外周血中可检测到的CLDN6-CAR-T细胞水平。几乎所有已移植的CLDN6-CAR-T细胞群体均经历CLDN6-LPX介导的激活和增殖。与未接种CLDN6-LPX的小鼠中的CLDN6-CAR-T细胞相比，与CLDN6阳性肿瘤细胞共培养时，接种CLDN6-LPX的小鼠中的CLDN6-CAR-T细胞更高。产生了一个关卡。 IFNγ水平显示出明显更高的抗原依赖性细胞溶解活性。此外，接受低剂量CLDN6-CAR-T细胞移植的小鼠也从重复的CLDN6-LPX疫苗接种中受益。在接受高剂量CLDN6-CAR-T细胞移植的小鼠中，达到高水平后，体内CLDN6-CAR-T细胞的增殖保持稳定。为了评估CLDN6-LPX的重复疫苗接种对

　　CLDN6-CAR-T细胞长期持久性的影响，每周将CLDN6-LPX接种给经历CLDN6-CAR-T细胞移植的小鼠。然后再加两剂更长的剂量。无治疗间隔--- 4和4.5周--- CLDN6-LPX疫苗接种。*初的CLDN6-LPX疫苗接种会导致CLDN6-CAR-T细胞快速增殖超过两位数，随后的每周疫苗接种会维持高水平的CLDN6-CAR-T细胞，导致外周血增加了总血淋巴细胞的15％。

　　鉴于CAR-T细胞治疗*突出和*严重的不良事件是细胞因子释放综合征（CRS），因此这些研究人员将CLDN6-CAR-T细胞与CARVac策略结合使用。当我们这样做时，我们有可能调查了全身细胞因子释放的增加。他们分析了在CLDN6-LPX后进行了CLDN6-CAR-T细胞移植的小鼠的血清IFNγ，IL6和NFα的水平。除了早期阶段IFNγ的轻度和短暂增加外，未观察到所测试的促炎细胞因子的显着增加。此外，接受CLDN6-LPX单次或重复接种的小鼠的脾脏在结构上没有明显的病理变化；在小鼠接受CLDN6-LPX重复接种后的不同时间。 ，它们的脾CD11c +树突状细胞和F4/80 +巨噬细胞的组成显示出暂时的减少，但是T细胞，B细胞，NK细胞的数量没有变化。*终，患有癌的小鼠在进行小鼠CLDN6-CAR-T细胞移植后接受了一次CLDN6-LPX或对照RNA-LPX疫苗接种。在没有CLDN6-LPX的情况下，CLDN6-CAR-T细胞对肿瘤的控制是不完全的，只会减慢肿瘤的生长。相反，在接受CLDN6-CAR-T细胞和CLDN6-LPX组合的10只小鼠中，有6只显示出对较大肿瘤的完全排斥，并且中位生存期明显更高。当用CLDN18.2-CAR-T细胞和CLDN18.2-LPX组合治疗荷瘤小鼠时，可获得相似的治疗结果。接下来，在具有CLDN6-阳性OV90异源移植瘤的小鼠模型中，重复接种CLDN6-LPX可能导致移植到这些小鼠中的人CLDN6-CAR-T细胞的特异性增殖。我确认过了。有效的肿瘤控制与外周血中高比例的CLDN6-CAR-T细胞相关，而CLDN6-LPX疫苗接种可导致CLDN6-CAR-T细胞在体内更有效地增殖。我们已经确认，它将带来良好的可持续性。在小鼠异源移植肿瘤模型中，CLDN18.2-CAR-T细胞和CLDN18.2-LPX的组合可以达到类似的治疗效果。这些发现表明CARVac可用于改善CAR-ΔT细胞的抗肿瘤作用。这提供了使用CAR-T细胞治疗难治性实体瘤的新策略。然而，这些结果是在临床前模型中获得的，并且它们是否与人类相同需要进一步研究验证。