CAR-T细胞 中国实验动物信息网 2020-09-30 370

　　表达嵌合抗原受体（CAR）的转基因T细胞（CAR-T细胞）在治疗B细胞恶性肿瘤方面的临床应用已经成功，但是细胞因子释放综合征（CRS）阻止了这种情况。对患者的治疗效果。众所周知，CRS是由急性发炎反应引起的，其特征是发烧，低血压和与血清细胞因子升高有关的呼吸衰竭。尽管据报道巨噬细胞参与了用CAR-T细胞治疗的人源化小鼠模型中CRS的病因学，但导致CRS的机制仍不清楚。注射到患者体内的CAR-T细胞会经历激活和增殖，迅速增殖的CAR-T细胞会在短时间内导致B白血病细胞迅速大量死亡。巧合的是，急性淋巴细胞白血病（ALL）患者的疾病负担也与CRS的发生率和严重程度密切相关。尚不清楚这种大规模的恶性B细胞死亡如何与CRS的发病机制有关。

　　细胞会经历不同类型的死亡。*初，人口稠密是程序性死亡的唯一受管制形式。然而，*近的研究已经鉴定出以前无法识别的程序性坏死，其特征在于细胞快速膨胀，祖细胞膜上的大气泡和促炎因子的释放。已经鉴定出至少两个程序化的坏死性细胞死亡途径，包括MLKL介导的坏死和GSMDD（GasderminD）或GSDME（GasderminE）介导的细胞凋亡。将RIPK1招募至TNF-α受体会与RIP3形成死亡复合物，后者会产生膜纳米孔，从而导致坏死。与MLKL不同，GSMDD或GSDME被炎性胱天蛋白酶（胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5和小鼠胱天蛋白酶11）或胱天蛋白酶3激活。它们产生插入细胞膜以形成和介导纳米孔的寡聚物。细胞燃烧。

　　在一项新的研究中，中国医学科学院，郑州大学，华中科技大学和北京大学的研究人员证明了人类B白血病细胞和其他靶肿瘤细胞表达足够量的GSDME。提供。 GSDME被Caspase 3有效激活，而Caspase 3被CAR-T细胞释放的Granzyme B激活，导致靶细胞发生热降解。热降解释放的因子刺激巨噬细胞产生促炎性细胞因子。这可能会导致接受CAR-T细胞疗法的患者发生CRS。这些研究人员发现，CAR-T细胞通过释放大量的穿孔素和颗粒酶B激活B白血病细胞的caspase 3-GSDME途径，从而引起热降解和随后的CRS。已经观察到CAR-T细胞经历增殖过程并且在体内的特定点达到非常高的增殖频率。因此，在相对较短的时间内，大多数靶细胞可能会发生热降解，活化的巨噬细胞会通过活化的胱天蛋白酶1产生IL-6和IL-1β，从而触发CRS。有。对这种分子机制的阐明为深入了解与CRS的严重程度，所治疗的CAR-T细胞的数量以及B白血病细胞的负荷有关的临床观察提供了见识。

　　检测人B白血病细胞，MCF-7乳腺癌细胞和小鼠B16黑色素瘤细胞中GSDME的表达，它起成孔蛋白的作用，其激活具有潜在危险并导致细胞死亡有可能。据报道，GSDME在许多测试的肿瘤细胞系中不表达。与此相一致，GSDME基因的启动子区域显示出高甲基化状态。这表明GSDME基因在细胞中遭受表观遗传沉默。 GSDME被认为是一种肿瘤抑制基因，可诱导caspase 3裂解程序所致的细胞死亡，从而使肿瘤细胞沉默GSDME的表达，从而进化出使肿瘤发生的表观遗传手段。可能是这样。然而，BSD白血病细胞和其他肿瘤细胞中GSDME的高表达表明GSDME可能在肿瘤细胞孔的形成中起替代作用。人们目前正在研究GSDME表达如何克服高甲基化调节，以及GSDME是否具有除孔形成以外的常规功能。在这项研究中的一个重要发现是，CAR-T细胞比未转染的天然T细胞释放更多的穿孔素/颗粒酶B。 T细胞释放的溶细胞效应分子取决于两个信号的激活：MHC抗原肽-TCR（信号1）和CD80/CD86-CD28（信号2）。信号2的完全激活取决于TCR信号的激活强度。由TCR信号激活的轻链激酶（LCK）使CD28酪氨酸残基磷酸化。同时，被TCR信号激活的LAT和SLP-76磷酸化并激活主要的CD28下游信号分子PLC-γ，而磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯（PIP2）为二酰基甘油（DAG）。和肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）。基于对T细胞活化和基因工程进展的了解，这些研究人员设计了针对人T细胞的合成CAR。 CAR设计的基本概念是将单链可变区片段（scFv）与CD3ζ细胞内信号传导模块连接，以在抗原结合后诱导T细胞活化。当前，这种模块化结构从单个CD3ζ信号域扩展到CD3ζ-CD28，CD3ζ–4-1BB或CD3ζ–CD28–4-1BB信号域，从而模拟信号1和信号2、鉴于CAR和它的抗原之间的亲和力可以比TCR和MHC肽复合物之间的亲和力高100倍，因此可以将这种优越的亲和力与共刺激信号相结合。 CAR-T细胞可以释放靶细胞通过CAR-T细胞产生热量所需的大量穿孔素/颗粒酶B。一旦进入细胞质，颗粒酶B可以将Caspase 3的无活性前体（Procuspase 3）裂解为活性形式。活化的半胱天冬酶3诱导细胞凋亡或GSDME裂解，裂解通过膜孔的形成引起热降解。但是，细胞具有快速修复祖细胞膜中形成的孔的能力。 GSDME是否引起热降解取决于膜孔形成与膜修复之间的平衡。尽管GSDME含量相同，天然TCRCD8 + T细胞仅引起低水平的GSDME裂解，而CAR-T细胞释放高水平的穿孔素/颗粒酶B并激活GSDME。由于释放出富含与损伤相关的分子模式（DAMP）分子的细胞质内容物，因此在热解中发生的裂解是高度促炎的。在这项研究中，这些研究人员证实，肿瘤细胞经历的热解会导致巨噬细胞caspase 1和GSDMD活化，从而导致释放大量促炎性细胞因子并发展CRS。 ..在这些促炎细胞因子中，IL-6和IL-1β尤为重要。在临床上，IL-6中和抗体被广泛用于预防和/或治疗接受CAR-T细胞疗法的患者的CRS。作为多方面的细胞因子，IL-6主要受转录因子如NF-κB，AP-1和STAT3的调控。病原相关分子模式（PAMP）分子（例如脂多糖（LPS））和DAMP分子（例如热休克蛋白（HSP）和HMGB1）通过激活这些转录因子来刺激IL-6来刺激巨噬细胞。可以生成。这些研究人员发现，HMGB1存在于可热降解细胞（接受热分解细胞的细胞）的上清液中，并直接激活巨噬细胞IL-6、 IL-1β以前体的形式合成，其释放取决于胱天蛋白酶1的激活，胱天蛋白酶1是由基质体严格调控的炎症诱导胱天蛋白酶。基质小分子NLRP3被多种刺激物广泛激活，例如微生物毒素，颗粒，晶体，β-淀粉样聚集物和细胞外ATP。在这项研究中，这些研究人员发现，吡咯烷细胞的上清液中含有ATP。用P2X7受体拮抗剂处理或降解ATP可能会干扰焦玻璃藻细胞上清液激活巨噬细胞胱天蛋白酶1的能力。在他们开发的小鼠CRS模型的帮助下，它们可以通过敲除靶肿瘤细胞的GSDME，敲除巨噬细胞或抑制caspase 1/GSDMD来进一步预防CRS的发展。我确认过了。阐明这种分子方法对于更好地了解与CAR-T细胞疗法相关的毒性至关重要。 2018年，Verena Staedtke及其同事发现儿茶酚胺阻滞剂可以阻止巨噬细胞释放促炎性细胞因子。因此，阻断GSDME与儿茶酚胺联用可以更好地治疗CRS而不会降低肿瘤清除率。

　　这项研究报道，CAR-T细胞通过GSDME依赖性途径在靶肿瘤细胞中引起热降解，而CAR-T细胞则导致靶细胞热降解的其他介质。可能有办法。*近的研究报道，CAR-T细胞可能会动员TNF-α介导这一杀伤过程，这可能与Granzyme B和Perforin无关。有。这一发现的一种可能性是，CAR-T细胞可以使用两步策略攻击目标细胞。颗粒酶B和穿孔素导致*波杀戮。当靶细胞逃脱*波攻击时，TNF-α开始第二波杀伤。这也可以解释为什么可以在不显着影响CAR-T细胞介导的杀伤作用的情况下阻止热降解。当前的研究表明，由CAR-T细胞和天然TCR-T细胞引起的细胞死亡类型之间存在机制差异，这是通过将肿瘤细胞死亡从热降解转换为凋亡来改变的。