动物实验,CRISPR 中国实验动物信息网 2020-09-28 1031

　　*近，中国科学院上海生物科学研究所，上海科技大学等研究人员已经开发出一种基于内含子的基因组编辑方法，使用CRISPR/Cas9系统实现高效的斑马鱼基因敲除。

　　杜九林，中国科学院上海生物科学研究所神经科学研究所研究员。他于1993年毕业于中国科学技术大学，并于1998年获得了中国科学院上海生理研究所的博士学位。他是中国科学院100人才计划的成员。他的主要研究方向是感觉整合以及学习和记忆行为分子，突触，神经回路机制和血管。神经调节发育和功能。

　　敲动物是生物学研究的多功能工具。例如，研究人员通常使用敲入动物来了解致死基因在后来的胚胎功能中的作用。也就是说，将loxP插入目标基因组位点以创建条件基因敲除动物。通过敲入的特异性细胞荧光蛋白标记或内源蛋白提供了一种在体内追踪这些细胞或蛋白动力学的强大方法。斑马鱼是生命科学研究中的一种新的脊椎动物模型。锌指核酸酶（ZFN），转录激活因子样效应子核酸酶（TALEN）或斑马鱼通过CRISPR/Cas9系统进行功能基因组编辑的研究已陆续展开，但基因敲入方法仍处于起步阶段在里面目前，仍然缺乏可行的方法。将大的DNA序列插入特定的基因组位点已成为斑马鱼相关研究的瓶颈。

　　今年4月，研究小组在“细胞研究”中报告了一种新的基因敲入方法。在这项新研究中，他们利用经由同源诱导修复（HDR）的小鼠基因敲入和经由NHEJ（同源末端结合）的细胞培养供体基因整合，开发了CRISPR /。通过Cas9的有效的斑马鱼基因敲入策略可广泛用于标记不同的细胞类型和标记内源蛋白质。研究人员使用这种策略专门标记了多巴胺能神经元，5-羟色胺激活的神经元，神经胶质神经细胞和内皮细胞。研究人员还成功地将EGFP标签添加到内源性神经胶质纤维酸性蛋白的羧基末端。在这种基因敲入系统中，研究人员从靶基因的内含子中选择了一个sgRNA靶，将sgRNA靶位点的DNA序列添加到靶基因的3'intergene区，并将其添加到供体质粒中。作为同源臂。该策略维持靶向内源基因的完整阅读框和5'和3'调节元件，从而维持靶基因的完整性。

　　此外，sgRNA靶标的内含子设计避免了NHEJ导致的不正确整合到外显子中。将此方法与基于外显子的方法进行比较，因为所有插入事件都在框架内。它可以使连锁效率提高3倍。将右臂（即目标基因的3'中间基因区域）添加到供体质粒中非常重要。根据这项研究，质粒臂的长度对于供体的制备并不重要，只要臂序列满足某些要求即可：1）sgRNA必须包含在左臂的内含子部分； 2）包含所有mRNA 3'UTR序列的3'基因间区域必须包含在右臂中。成功进行基因敲入的另一个重要因素是sgRNA切割的效率。可以设计几种sgRNA来靶向左臂的内含子序列。对于敲入实验，有必要选择具有*高切割效率的sgRNA。