血管渗漏,慢性视网膜新血管形成,动物模型 中国实验动物信息网 2020-07-23 1866

　　视网膜血管疾病，例如渗出性年龄相关性黄斑变性（eAMD），糖尿病性黄斑水肿（DME）和增生性糖尿病性视网膜病变（PDR），均会导致持续性和进行性血管渗漏。该疾病表明渗漏和异常血管生成。脉络膜新生血管（CNV）是eAMD的重要功能。病理性新血管形成来自脉络膜血管，破坏了Bruch的膜并穿透了视网膜下间隙。 CNV血管发育不成熟，内皮细胞通透性增强，内皮细胞紧密连接丧失和周细胞完整性，可导致积液和出血，导致失明。在DME和PDR中，高血糖症引起的损害可引起缺血和炎症，导致玻璃体和视网膜中持续的液体蓄积以及视网膜新血管形成（RNV），导致视网膜脱离和失明。被连接。在这些常见的血管生成和缺血性疾病中，血管内皮生长因子（VEGF）是内皮不稳定的主要介质，可导致持续的血管通透性以及脉络膜或视网膜新血管形成。目前，CNV，DME和PDR的护理干预标准是贝伐单抗，兰尼单抗和aflibercept联合中和VEGF，从而限制了其病理作用。传统处方有明显的治疗作用，但通常有选择：性和短暂的治疗作用。大多数患者受益于抗血管内皮生长因子治疗，但是由于这些治疗的持续时间有限，因此需要每月玻璃体内注射（IVT）以获得*佳效果。偶尔和不理想的加药时间表通常被用作折衷方案。因此，患者和卫生保健提供者非常需要持续时间长，可以有效稳定脉管系统并减少病理性血管生成的新的和/或抗血管内皮生长因子疗法。 ..对于与人眼非常相似的视网膜血管疾病模型（例如非人灵长类动物（NHP）），一项挑战是缺乏慢性血管渗漏和/或人eAMD，DME，PDR的血管生成反应特征。 ..在啮齿动物和NHP激光诱导的eAMD的CNV模型中，瞬态脉管系统脉管系统渗漏和血管生成反应在激光破坏Bruch膜后持续2-3周，然后自发平息。抗VEGF治疗加速了这种诱导的病理学的消退，但在人类中，CNV病理学在去除抗VEGF药物后得以恢复并持续存在。因此，建立持续的和反复发生的血管渗漏和血管生成的模型极大地帮助并加速了对解决病理性血管不稳定和血管生成的多种临床表现的长期干预措施的评估。 DL-α-氨基己二酸酯（DLAAA）模型是在大鼠和兔子中报告的一种慢性渗漏模型，其中筛选了常见的候选药物。 DLAAA是一种选择性神经胶质细胞毒素。据报道，它抑制谷氨酰胺合成酶的作用，损害更广泛的穆勒细胞的视网膜稳态功能，导致神经胶质功能障碍和死亡，并导致血视网膜屏障的破坏。 DLAAA注射后两个月，视网膜下血视网膜屏障被破坏，血管渗漏和曲折度增加。近期的一些研究表明，IVT给兔子施用DLAAA后12-18个月，血管渗漏和RNV会增加，抗VEGF药物贝伐单抗，兰尼单抗，阿柏西普和DARPins靶向VEGF。已显示-A165抑制了此类病理。大鼠，兔子和人的视网膜血管和神经元的解剖结构不同，但猴子和人的基本相同。猴的脉管系统，视网膜分割，猴与人之间的基础边界，视网膜神经元与神经胶质亚型的比率以及黄斑的存在是同源的。在这里，我们报告由DLAAA引起的慢性血管渗漏的新NHP模型。慢性视网膜血管渗漏和新血管形成的临床前模型可以筛查短效和长效抗血管生成化合物在疾病发展多个阶段的功效。方法：动物：总共使用了8只成年雄性和9只雌性非洲绿猴（雄性：5.2-6.9kg，雌性：3.1-4.1kg）。筛检前的眼睛检查，包括裂隙灯（SL）检查，彩色眼底照相（CFP），荧光素血管造影（FA）和光学相干断层扫描（OCT），以确认没有眼睛异常去做。每天两次对笼子进行观察，并在计划的眼睛检查期间进行额外的监测。招募动物，在给予DLAAA后6-9周分组，并成对饲养。

　　DLAAA模型：在第0天，该组的两只猴子的两只眼睛（OU）均接受了IVT注射的DLAAA（5 mg）。将DLAAA溶于1M盐酸中制成100 mg/mL储备液，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释，将pH调节至7.4、然后通过0.2微米过滤器过滤。在给药前准备少量的DLAAA溶液（25 mg/mL），并储存在-80°C下。所有等分试样均由DLAAA批次制备。在给予IVT之前，将1％阿托品局部涂抹在两只眼睛上，以实现完全的瞳孔扩张。用1-2滴0.5％的Proparacaine麻醉眼睛表面。使用连接到27号针头的1 mL注射器进行玻璃体穿刺，取出100μL玻璃体液并保存在-80°C。给药前，进行玻璃体穿刺以抑制眼内压升高。玻璃体穿刺的成功率为70％。使用0.3 cc胰岛素注射器和31G 0.5英寸针头将DLAAA溶液（5 mg/200μL）输送到玻璃体中心后3 mm。注射后立即使用3种抗生素软膏（新霉素/硫酸多粘菌素B /杆菌肽锌）和1％阿托品软膏。如果由DLAAA引起的病理严重或观察到视网膜脱离，则排除眼睛。预先定义的排除标准包括：1）严重的病理发展，超出血管拱廊或周围视网膜的大量或广泛渗漏，2）严重的出血性眼病，或3）水肿和纤维化。浆液性或完全性视网膜脱离引起的视网膜脱离和牵拉引起的组织重塑。这些标准的应用导致25％接受DLAAA的动物被排除在外。抗VEGF注射：在给予DLAAA的八或九周后，对荧光素血管造影图像进行分级，以评估DLAAA诱导的视网膜血管渗漏的严重性。请参阅标准泄漏评分表。在治疗前10周重复FA成像，以确认动物任务并捕获基线FA图像。在施用抗VEGFIVT之前，使用1-2滴0.5％的丙草卡因麻醉眼表。使用预先连接31G5/16英寸针头的无菌0.3 mL胰岛素注射器将抗VEGF药物注入玻璃体腔。将针放在颞下象限边缘的后方2毫米处，并将其指向玻璃体中心。眼睛接受媒介物（0.9％盐水），50μL）或aflibercept单次IVT注射。根据非洲绿猴的玻璃体的相对体积（约2.7 mL）和人玻璃体的相对体积4.4 mL选择抗VEGF剂的剂量水平。所有对侧眼睛都接受相同的治疗。注射后局部施用新霉素/硫酸多粘菌素B /细菌素抗生素软膏。在2天内给药，并在研究期间进行随访。

　　眼科检查：服药前，D  LAAA管理干预后每两周一次，研究结束时每周一次，眼表完整性，总体眼部健康状况，对DLAAA管理的广泛眼部反应，用裂隙灯显微镜检查眼睛直到对瞳孔散大的耐受性得到证实，确认有1％HCl环，对戊糖酸盐反应正常。使用改良的Hackett-McDonald评分系统对眼科检查结果进行评分。

　　彩色眼底照相：使用具有佳能6D数字成像硬件和新型视觉眼底图像分析系统软件的Topcon TRC-50EX视网膜相机。每周一次，干预后每两周，获取视网膜的双侧彩色眼底图像，直到研究结束。

　　荧光对比：静脉注射0.1 mL/kg 10％荧光素钠后，使用Topcon-TRC-50EX视网膜相机或Heidelberg HRA + OCT，高分辨率荧光素血管造影（FA）具有固定的增益和闪光强度。 ）获取。在几分钟之内收集图像。使用评分系统对视网膜区域进行评估和评分，以显示整个血管造影术中的血管渗漏情况，使用ImageJOI工具测量1分钟内原始血管造影术渗漏区域的总荧光强度。定量评估（从第10周到研究结束）

　　泄漏分析：使用自定义分级量表和多个ROI自动化分析评估DLAAA引起的泄漏，该分析显示出*大的治疗效果仅限于显示渗漏和时间点复发的选择：检查“病变大小”和“病变严重程度”标度以进行相对FA图像系列检查（荧光素给药后约5秒至6分钟），评估泄漏的大小和严重性。使用荧光素注射液。在1分钟后获取的FA图像上测量绝对荧光强度。每个网格定义14个感兴趣区域（ROI），分别代表上（S），鼻（N），下（I）和颞（T）区域以及中央凹和视盘内部的中央视网膜（1 ），中间（2）和外部（3）部分。从每只眼睛的每个基线图像（在DLAAA注射之前），确定ONH相对于中央凹的位置，并添加ROI网格。覆盖层可用于眼睛的所有位置。 结果：DLAAA的使用会破坏视网膜，导致结构完整性，液体积聚，血管曲折，病理性血管渗漏和重塑。在FA成像中，从第二周开始，主要在黄斑内和周围观察到高荧光渗漏，在一些眼睛中，在血管拱廊内和周围观察到渗漏。泄漏在*初的4周内迅速发展，在8-10周内稳定下来，并持续超过18周。另外，在一些眼睛中观察到中央凹的无血管区域的扩大，并且中央凹周围的毛细血管网消失了。第4、6和9周的早期FA评估显示出黄斑中有新血管形成的迹象。另外，在给予DLAAA后，中央凹周围的毛细血管和微血管常常显示出扩张和渗漏的异常。这是MacTel在早期FA成像中非常明显的征兆。彩色眼底照片还显示了类似于MacTel的血管病变。眼底镜检查和彩色眼底图像显示黄斑部血管阻塞与血管造影数据和临床相关性一致。另外，观察到视网膜变白区域，特别是神经纤维层的水肿与灌注不足相一致。