中洪博元,动物造模,溃疡性结肠炎 中国实验动物信息网 2020-07-21 2065

　　[主要试剂] 5 % 2 ,4 ,6 ,TNBs 无水乙醇

　　[方法] 各组大鼠造模前1 天均禁食24 h ,氯胺酮腹腔注射轻度麻醉0.15ML/100G 正常组:用2MM聚丙烯管插入大鼠肛门上段 8 cm 后 ,一次性注入 0.85 %NaCl 0.6 ml;模型 Ⅰ组:按 50 mg/ kg 计算 TNBs (约等于 TNBs 原液 0. 09 ml/ 100 g) 加 50 % 乙醇0.25 ml ,用聚丙烯管插入肛门上段 8 cm 后一次性注入混合试剂;模型 Ⅱ组:按 100 mg/ kg 计算 TN1Bs (约等于 TNBs 原液0.18 ml/100 g)加50 %乙醇0.25 ml ,用聚丙烯管插入肛门上段 8 cm 后一次性注入混合试剂.1 周后处死动物 ,进行组织形态学评分和光镜评估。

　　[结果] TNBs 100 mg/ kg剂量下引起的 UC模型 ,肉眼见结肠黏膜多处溃疡 ,黏膜显著充血水肿。组织学检查发现黏膜及黏膜下层有大量中性粒细胞及淋巴细胞、巨噬细胞、纤维细胞浸润 , 肉芽组织及隐窝脓肿形成 , 50 mg/ kg 剂量时有一较轻度的损伤.实验的*佳造模剂量为 100 mg/ kg。

　　免疫复合物Π福尔马林模型

　　[方法] 取家兔新鲜结肠粘膜组织 ,用玻璃匀浆器制成匀浆 , - 20℃下冷冻 24h,冻融后以 4000rΠmin速度低温离心30min,取上清液用双缩脲法测其蛋白含量 ,置入冰箱备用。使用时加入等量freund完全佐剂 ,制成抗原乳化剂。各组造模大鼠均于第 1d 于大鼠左足跖注射抗原乳化剂0.4mL(含抗原4mg) ,于第10、17、24、31d分别于右足跖、腹股沟、腹腔、背部注射抗原乳化剂 0.8mL(含抗原 8mg,末次注射不加佐剂) 。确定大鼠体内产生抗结肠抗体后 ,将大鼠用氯胺酮麻醉(100mgΠkg) ,用 1.5 %的福尔马林 2mL 灌肠 ,留置1h,用生理盐水洗净排出 ,再用抗原液 2mL(含抗原 8mg) ,不加佐剂灌肠 ,留置2h,然后洗净排出。于上述处理第二天 ,大鼠出现软便、稀便 ,甚则脓血便 ,精神萎靡 ,呈拱背状。取 4只大鼠处死取其结肠 ,病理显示粘膜表面部分糜烂 ,固有层存在少量慢性炎症细胞 ,但未见溃疡 ,可能与取材部位不当有关。

　　[优缺点] 此种造模方法虽合乎 UC发病机制 ,且达到全身免疫异常和局部炎症病变的结合 ,但模型制作过程较繁琐 ,周期较长 ,动物死亡率高 ,且重现性不理想 ,其肠道病理变化的程度与人类 UC的病变过程不太符合 ,达不到科研实验的要求。

　　新UC动物模型的建立

　　方法 先于大鼠足跖、腹股沟 注射两次上述抗原乳化剂0.8mL(每次含抗原 8mg) ,间隔时间为 2 周 ,在大鼠全身致敏、发生免疫异常的前提下 ,再用 TNBS(购 于 Sigma公司)与无水乙醇等体积配比的混合液按 100mgΠkg 剂量局部灌肠 ,使大鼠肠道发生局部炎症变化

　　优缺点 此方法既达 到全身免疫异常与局部炎症病变的共存 ,又可产生与人类UC较为接近的临床症状及肠道病变情况。在局部灌肠后的第 5d,大鼠大便次数增多 ,且为稀便或粘液便 ,动物精神萎靡 ,体重减轻明显 ,瘦弱懒动 ,呈拱背状。分别于局部灌肠后 第3、6、9周各取4只大鼠结肠组织 ,观察均可见粘膜充血、水肿 ,肠壁增厚 ,镜下表现为病变累及肠壁深层 ,溃疡明显 ,并 有中性粒细胞浸润等炎症变化;大部分大鼠可见稀便或粘液 便、精神萎靡等症状。第 12 周取 4 只大鼠结肠组织 ,观察仍 可见肠壁增厚、狭窄 ,镜下见到肠壁纤维组织形成 ,部分仍有 溃疡、中性粒细胞浸润等炎症变化。该模型方法重现性好、 死亡率低、维持时间长 ,并且符合人类 UC病变机制 ,既避免了免疫复合物Π福尔马林模型繁琐、重现性差、死亡率高等缺 点 ,又避免了三硝基苯磺酸Π乙醇模型的单纯细胞免疫反应、 维持时间短等缺点 ,取得了较为理想的人类UC的动物模型。

　　过氧化亚硝酸钠模型

　　使用过氧化亚硝酸钠诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型是目前国际上*新的实验研究造模方法之一，1993年由DANIEL等制作成功，我国学者郑氏等2001 年首次用大鼠建立并在方法学上作了初步探索。方法为大鼠乙醚麻醉下，用内径2MM的硅胶管插入肛门6CM，用注射器注入 0.5ML不同浓度的过氧化亚硝酸钠，然后再注入一段长0.25空气，以清除沾在注射器上与导管中的溶液。- 周后处死大鼠，做病

　　理切片，光镜下观察发现亚能有效诱导实验大鼠UC产生，且剂量以中度浓度6.55MM为佳。病理学可见黏膜损伤较严重，充血水肿明显，有多个溃疡产生，肠腔变狭，镜下溃疡较深，深达肌层。成功的关键是控制药物适当浓度和稳定性，过氧化硝酸钠在常态下极易分解，试剂放置时间不应超过 24小时。

　　本模型具有制作简单，重复性好，制作成本低廉的优点，其形态学改变与氮氧化机制有关，能反映溃疡性结肠炎发病的部分本质机制，也是目前国际上比较*的模型之一。适用于中医药防治溃疡性结肠炎的研究，尤其是如何深入阐明中药复方抗氧化及调控一氧化氮作用机制。

　　恶唑酮法

　　为近年来出现的一种较新的造模方法.恶唑酮(OXZ)为染料,农药,医药的重要中间体,也是一种经典的半抗原物质"经免疫学研究发现,诱导的小鼠结肠炎模型,细胞因子分泌以IL-4过量生成为主,属于TH-2亚型炎症反应,而TH-1反应的主要细胞因子IFN-在此模型中降低"引起的炎症反应*终被继发的转化生长因子2B(2B)大量分泌所均衡,疾病趋于自限性[10]"方法:/雄性小鼠,乙醚麻醉后经肛门插入细导管4,缓慢注入

　　150L(6,溶于50%乙醇),随后将小鼠持续倒置30"造模2内出现懒动!腹泻!肉眼血便,一般4内可有半数左右死亡,剩余鼠于第7左右病情好转,10~12基本痊愈,因此建议于造模后3处死动物,采集样本"结肠肉眼观可见病变以远端结肠为主,肠腔扩张,粘膜充血水肿,糜烂溃疡,伴伪膜形成"镜下见大肠粘膜溃疡,伪膜形成,腺管广泛消失,粘膜下组织出血,重度中性粒细胞!淋巴细胞!浆细胞全层浸润[11]"该法制作简单,模型产生快,重复性好,病变与人类相似,特别适合用于发病机制和新药开发的研究"缺点是疾病维持时间短,自愈性强,无慢性期变化,不适合模拟慢性复发性类型的研究"

　　碘代乙酰胺法

　　碘代乙酰胺()为巯基封闭剂,可

　　使含二硫键的蛋白质分子完全变性并维持还原状

　　态,作为蛋白酶抑制剂!巯基封闭试剂用于生物质谱

　　分析!蛋白质分子结构分析和双向凝胶电泳样品制

　　备等"碘代乙酰胺用于动物结肠炎模型建立的主要

　　机制是:碘代乙酰胺可使细胞蛋白质变性,破坏细胞

　　正常结构和功能,从而使肠粘膜完整性损害,导致炎

　　症发生;另外,碘代乙酰胺还可抑制肌酸磷酸激酶

　　(),使线粒体功能受到影响,而造成肠上皮细胞

　　功能异常"方法:雄性大鼠麻醉,给予0.23%的

　　碘代乙酰胺(溶于1%的甲基纤维素)灌肠"造模

　　24后动物出现懒动!腹泻!血便等,炎症反应于造

　　模后1周左右达到*高峰,2周左右粘膜开始再生,疾病趋向自限,3周左右痊愈"结肠大体可见粘膜

　　充血水肿,糜烂呈颗粒状,多数小溃疡发生,可有粘

　　连"镜下见散在粘膜表面溃疡,伴大量炎性细胞浸

　　润,隐窝损害,腺管受损,上皮完整性遭破坏[12213]"

　　该法制作简便,除可诱导结肠炎外,还是诱导CD

　　的理想模型"缺点是自愈性强,不适用于慢性

　　期疾病的研究"

　　葡聚糖硫酸钠法

　　二硝基氯苯法

　　乙酸法

　　角叉菜胶

　　抗原诱导 胞壁酰二肽

　　复合法诱导的溃疡性结肠炎(2,4二硝基氯苯+乙酸联合建模法)

　　胎鼠结肠种植法

　　大鼠结肠细菌菌株法

　　吲哚美辛结肠炎模型

　　肽聚糖多糖(PG-PS)结肠炎

　　对UC动物模型的体会

　　胃肠道内有大量的抗原物质存在 ,如致病菌、正常菌群、炎症性肠病动细菌毒素、病毒、代谢的化学物质以及饮料与食物等。因此 , 肠免疫系统具有两个方面的功能 ,既要保护肠粘膜 ,抵御致 病因子入侵;又要吸取营养物质 ,耐受正常的肠道菌群。所 有这些肠内容物均可能是潜在的免疫源 ,但在机体具有正常 调节能力时 ,不会发生炎症。肠上皮细胞粘膜屏障的破坏为 大量摄取肠抗原创造了条件 ,无节制的免疫反应以及免疫调 节失衡是溃疡性结肠炎的免疫学特征 。上述造模方法中体现了这个发病过程中的重要环节 ,即乙醇是始发因素 ,起 破坏肠粘膜屏障的作用 ,使灌入的 TNBS作为半抗原引发肠道局部的免疫损伤反应 ,结合大鼠全身免疫调节失衡 ,使炎症过程逐级放大 ,*后造成组织损伤以及结肠炎的病理变化和临床表现。

　　但此种模型制作方法仍然缺乏自发和复发的特点 ,即缺乏人类UC缓解和复发交替出现的特点。在以后的模型研究中 ,笔者认为应该着重考虑以下两点问题:*是 UC动物模型维持时间的问题 ,免疫方法制作 UC动物模型虽然可以使结肠病变维持较长时间 ,但由于大鼠的肠道修复能力较强,故维持多久才能符合人类 UC是今后应重点考虑的问题;第二是如何解决临床缓解和复发的问题 ,对于 UC模型 ,能否做到给药则使病变缓解 ,停药后炎症又出现是我们今后需要进行探索和研究的内容。相信随着诸多科研者在此领域不断的努力和创新 ,更加理想的 UC动物模型一定会逐渐符合人类UC的病变过程 ,为溃疡性结肠炎的药物治疗开辟更加广到全身免疫异常与局部炎症病变的共存 ,又可产生与人类 阔的新天地。