动物实验,新生血 中国实验动物信息网 2020-09-10 832

　　摘要：本研究的目的是神经激肽1受体（NK-1R）拮抗剂诱导已建立的角膜血管新生（CNV）的退化？过磷酸氢钙？

      方法：对20只C57BL/6只小鼠进行碱性灼伤。 7天后，当形成角膜血管生成时，将10mg/ml的磷沙坦酮每天6次局部注入右眼，持续10天。同时，建立了一个对照组，并用盐水治疗了角膜新生血管的眼睛。为了评估福沙普坦在10只健康小鼠中的安全性，他们接受了相同的局部治疗10天。 Vesselj插件用于测量血液生成和淋巴管生成。还评估了次要终点，例如白细胞浸润，角膜混浊和角膜荧光素染色。通过流式细胞仪确定炎性细胞的组成。使用未配对的t检验，Mann-Whitney U检验或（在某些情况下）双向方差分析来评估组之间的差异。 结果：局部注射福马西坦可以显着减少（i）CD31 +血液角膜血管生成，（ii）lyve1 +淋巴角膜血管生成，以及（iii）CD45 +白细胞浸润。此外，经泊沙普坦处理的角蛋白显示出降低的不透明性，对角膜荧光素染色的损害，并减少了中性粒细胞（-72％）和巨噬细胞浸润。局部应用福沙普坦对眼表无毒：未发现结膜炎，不透明，穿孔或角膜荧光素染色的迹象。同样，角膜TUJ1 +神经密度也不受影响。结论：我们的数据表明，NK-1R拮抗剂（如fosapretan）可能是抑制已建立的CNV的一种新的有前途的治疗工具。

　　简介：角膜血管生成（CNV）是重要的医学领域。全球失明的第二个原因是当前治疗方案有限。已经显示许多化合物，包括抗血管内皮生长因子，在*近的CNV发作的患者中是有效的，并且它们在诱导血管退化中的作用仅限于降低血管的口径。从临床角度来看，治疗侵入皮层的血管而不是阻止其在角膜中生长非常有益。这项研究的目的是测试NK-1R拮抗剂phosapipitant在诱导角膜血管生成和淋巴管生成中的退化作用。广泛的角膜疾病，包括创伤，感染和角膜缘上皮干细胞的丧失，通常与CNV相关，而CNV直接与：（i）视力丧失和（ii）角膜免疫特权的丧失有关。此外，现有CNV的程度与角膜移植排斥的风险直接相关。 CNV的治疗是有限的。局部类固醇由于抑制炎性细胞的迁移和炎性细胞因子的分泌而被广泛使用。长期使用类固醇是*有效的方法，可引起视力障碍的副作用，包括诱发白内障，青光眼和伤口愈合障碍。诸如光动力疗法，细针透热疗法，激光诱导的光凝疗法，结膜，角膜缘或羊膜移植等外科手术或外科治疗已被用于治疗具有可转换能力的成熟CNV。抗血管内皮生长因子药物在临床试验中用于治疗现有的CNV。局部给药有效地减小了血管的直径，但是并没有导致血管生成侵入的角膜面积（即，侵入面积）的显着减小。*后，*近的CNV治疗可能引起副作用，例如上皮缺损，角膜实质变薄和神经毒性。抗血管内皮生长因子在新血管覆盖皮下细胞之前对新血管非常有效，但稳定的CNV却不然。角膜血管生成（CNV）通常与炎症相关。神经源性肽在角膜炎症和CNV中起重要作用。这是因为角质在整个身体中接收到*密集的感觉神经。具体而言，P物质（SP）是一种神经肽，含有takinin家族的11个氨基酸，在感觉神经末梢（包括角膜末梢）和炎症过程中由各种免疫细胞分泌。 P物质通过与高亲和力神经激肽1受体（NK-1R）结合而起作用。该受体在神经，免疫细胞和上皮细胞中表达。K-1R的激活促进淋巴细胞增殖并诱导炎症介质的释放，例如白细胞介素和启动和维持CNV所需的生长因子。先前已经提出，NK-1R拮抗剂可以在血管生成相关的眼疾中具有治疗用途。局部给予高度相容和竞争性的NK-1R拮抗剂（Lampitant）可以有效预防CNV的发作。在血管侵入角膜表面的至少50％之后，我们测试了选择性NK-1R拮抗剂是否通过阻断SP来阻断现有的CNV。为此，我们使用了NK-1R拮抗剂fosapretan，这是一种临床认可的水溶性药物，可预防恶心和呕吐。 Fosaprepitant是一种前药，可通过上皮细胞，内皮细胞和角膜细胞在皮层中表达的普遍存在的磷酸酶在体内轻易转化为活性aprepitant。材料和方法：角膜碱烧伤模型：所有实验（总共80只小鼠）使用6-8周龄的雌性C57BL/6只小鼠。在60只小鼠的右眼角膜中诱导了CNV。简而言之，在全身麻醉后，在角质中心的2μl0.15 mMaOH会在角质层上造成碱性灼伤，可以用20 ml常规生理盐水彻底冲洗。接下来，以平行于瓣膜环的旋转运动用角膜实质刮除角膜上皮。为了防止感染，在前三天内每天用抗生素药膏治疗一次眼睛。 7天后，用裂隙灯显微镜SL990检查角膜并照相。角膜血管生成的临床测量。角质被分为4个象限，得分范围从0分（无血管）到4分（4个象限血管）。在60只眼中，有20只被排除在研究之外。五只眼有孔，两只眼有白内障，十三只眼有一个象限的血管生成。根据CNV的临床评分系统，将剩余的眼睛平均分为两组（每组20例）。在第二个独立实验中，每组使用30只10只眼的小鼠。氟哌啶酮治疗：选定的两个组接受总体积为10μl磷酸盐缓冲液（PBS）或10 mg/ml fosapidan溶于10μl溶媒对照中，每日右眼局部6次，共10天。注射。角膜损伤后7天开始治疗，一旦建立CNV，至少要覆盖50％的角膜表面。我们决定给予用于治疗恶心和呕吐的静脉注射浓度（1 mg/ml）的10倍。在初步研究中，1 mg/ml福沙普坦不能减轻CNV和炎症。在其他两组中的十只健康动物（总共20只小鼠）每天右眼接受6次10毫克/毫升的局部Fosapretan或10μlPBS，连续10天，以评估Fosapretan的毒性。做到了每次治疗后，在窄间隙显微镜下进行临床检查以盲目检查总体病理变化和药物毒性。如前所述，评分系统（0-4、0 =完全透明，4 =完全不透明）用于评估角膜的不透明度。体内角膜荧光素染色用于评估健康眼和使用福沙普雷坦治疗后被碱性灼伤的眼睛的角膜上皮缺损。在SL990裂隙灯显微镜的蓝光下拍摄眼睛。使用IMAGEJ1.44P软件分析图像，以评估绿色荧光面积与总角膜面积之比。在第7天和第17天（分别在治疗之前和之后），在图像J中分析裂隙灯图像，以确定体内的CNV进入区域。 角膜血管生成和白细胞浸润的分析：在治疗结束时，将角膜切除，固定并如上所述进行免疫染色，并标记为：大鼠抗CD31、山羊抗Lyve1和兔抗。 CD45、用DAPI对角膜进行对比染色，将其平放并用荧光显微镜照相。为了获得整个角质层的二维重建，将收集一组六个相邻的重叠图像并将其重新映射到编辑配置。使用*近开发的名为Vesselj的ImageJ插件对这些数字图像进行了分析。它可以半自动定量角膜血液和淋巴管生成。用共聚焦显微镜计数每个视野中的双阳性（DAPI + CD45 +）细胞，以量化CD45 +细胞的浸润；按上述方法用局部福斯达dam和神经处理健康的角蛋白。处理标记TUJ1（兔抗β3管蛋白多克隆抗体）进行了免疫染色，以评估药物的潜在神经毒性。成像方法用于量化福沙皮坦和媒介物治疗组的外周基底层丛。流式细胞术分析：去除十二个角蛋白/组，并在第7天（开始治疗前）和第17天（用Fosapidem或赋形剂治疗后）合并。用20 mM EDTA去除角膜上皮后，将单细胞用胶原酶IV（2 mg/ml）和DNase I（0.5 mg/ml）在含有Ca2 +/Mg2 +介质的溶解HBSS溶液中处理。形成。悬挂。在37°C振荡60分钟后，将细胞悬液以70μm过滤，并用含有0.5％BSA/2 mM EDTA的冷PBS洗涤。将所有细胞悬液与大鼠抗FcγIII/ II受体阻断抗体（1:50）在冰上孵育20分钟。然后，在4°C，用以下主要抗体染色30分钟。先前滴定的主要抗体是大鼠抗CD45-PB（1：200），大鼠抗CD11B-APC-eFluor780（1：800），大鼠抗Ly6G/Ly6C（GR1）-PE/Cy7（1：200）。 ）和大鼠抗F4/80-FITC（1：100）。洗涤细胞并重悬于含有7-氨基放线菌素D（1：100）的缓冲液中。

　　结果：局部应用磷磷坦可能会减少稳定的角膜新生血管：CNV建立后7天，将动物分为两组（每组20只）并按象限测量将CNV和不透明度均匀随机化。在治疗期间，每组的一只眼睛发生穿孔（第11天为Fosapidem，第9天为媒介物），并从分析中排除。局部注射fosapantant 10天可显着减少（i）角膜血管生成和（ii）角膜淋巴管血管生成。另外，第二个实验证实了该数据，显示经福沙普坦治疗的眼血管生成减少了33％，淋巴血管生成减少了51％。另外，在体内和体外，发现经福沙普坦处理的角蛋白具有减小的血管直径。福沙普坦的局部使用可改善角膜透明度，并且不影响上皮伤口的愈合。福沙普坦治疗可有效降低角膜混浊，但与第二个独立实验相比没有显着差异。此外，用福沙吡丹治疗的组中有47％的眼睛（总共19个角膜中的9个），相比之下，在溶媒组中（21个角膜中的4个）21％的眼睛在角膜的中央区域有血管。没有在这两个实验中，局部应用福沙普坦并没有降低上皮伤口闭合的速率。仅在一个实验中，处理10天后荧光素染色略有减少。局部应用fosapitant减少

　　角膜炎性细胞浸润：CD45染色分析显示，与媒介物组相比，fosapitant治疗后角膜基质内的白细胞显着减少。在第二个实验中证实了这种减少。流式细胞仪分析显示，药物治疗后，角质层骨髓浸润细胞（CD45 + 7AAD-CD11B +）的减少率很高。尤其是，磷脂酰肌醇诱导（i）巨噬细胞，骨髓腔中GR1dimF4/80 +细胞的显着减少以及（ii）GR1highF4/80-中性粒细胞。晒斑对眼睛表面无毒：穿刺检查和评估后，局部福沙汀（10 mg/ml，6次/天，连续使用10天）对健康眼睛的眼睛表面无毒：充血/结膜炎或穿孔的迹象。此外，治疗后角膜仍保持透明。此外，福沙普雷坦对角膜上皮无毒，对荧光素染色呈阴性。K-1R拮抗剂对角膜神经无毒。K-1R拮抗剂对角膜神经无毒性，这是因为用抗TUJ1抗体免疫染色的周围下基底神经丛的典型组织学以及TUJ1 +神经的定量。讨论：P物质通过与受体NK-1R结合而促进CNV。*近，我们显示了局部注射NK-1R拮抗剂光亮剂可以预防角膜血肿和淋巴管生成。在这两个独立的实验中，发现高亲和力NK-1R拮抗剂fosapidem 10 mg/ml可显着降低已建立的CNV。除了抑制CNV外，福沙汀的治疗还减少了角膜炎症。免疫染色和流式细胞仪数据证实了这一点。众所周知，白细胞，特别是巨噬细胞，表达NK1受体，其活化导致巨噬细胞活性和趋化性增加，并释放血管生成因子，例如SP和VEGF。已显示白细胞有助于角膜造血和淋巴管生成，因此治疗后减少白细胞可能会降低CNV的作用。因此，可以推断，磷沙必胺调节炎症细胞的募集和活化，*终导致血管密度降低。此外，Fosapreitant还改善了其他与炎症相关的临床结局，例如角膜透明性和上皮缺损大小。这与先前对各种NK-1R拮抗剂的研究一致。*后，局部使用fosapident对眼表无毒。用健康的眼睛进行检查时，没有结膜炎，穿孔，角膜混浊或上皮缺损的迹象。治疗不影响下脑神经丛。这与先前关于其他NK-1R拮抗剂的观察结果一致。

　　结论：Fosapidan：（i）目前是唯一批准用于临床的水溶性NK-1R拮抗剂，（ii）没有明显的眼表毒性，（iii）使用动物模型有效减少现有CNV的生长因此，福沙普坦被认为是人类CNV临床试验的理想候选者。