动物造模,周围神经 中国实验动物信息网 2020-09-10 494

　　简介：哺乳动物的外周神经系统（PNS）保持较高的再生能力，甚至成年人也可以实现远距离再生和轴突功能恢复。这种再生的机会在成年哺乳动物中减少，减慢，不完全和/或无效的周围神经修复。但是，在了解PNS衰老的分子和细胞机制方面的有限进展阻碍了老年患者合理康复治疗的发展。因此，我们的目的是发现衰老如何影响周围神经的维持和再生。创伤后，周围神经经历多步修复，包括壁变性，轴突再生和靶向神经支配。沃勒变性的特征如下： （A）将Schwan细胞与相关轴突分离，（b）将这些Schwan细胞转化为“修复的Schwan细胞”表型，（c）破坏血液神经屏障，以及（D）组织中的巨噬细胞它与（E）“修复Schwan细胞”一起流入并吞入轴突和米林蛋白衍生的碎片。在再生阶段，巨噬细胞支持“ Schwan细胞修复”，介导轴突再生并重新调节靶组织。当炎症过程消失并且“天鹅细胞修复”重新分化时，再生完成。成功的周围神经修复需要几种不同类型的神经元，Schwan细胞和免疫细胞。神经元的内在生长潜力似乎不受衰老影响。这表明年长动物的缺陷是由环境破坏引起的，而老化的Schwan细胞和巨噬细胞清除杂物的效率较低。两项主要研究证实，年长动物中轴突再生的环境存在缺陷。前者观察到雪旺细胞行为的年龄依赖性差异，并延迟了修复程序的激活。 Schwan细胞和巨噬细胞的体外摄食减少表明，老年啮齿动物的神经再生缓慢是Schwan细胞和巨噬细胞无法修复其功能的原因。这项研究的目的是调查可再生完整旧神经的炎性神经环境。通过影响Schwan细胞的修复过程，我们证明了炎症神经微环境的变化是影响老年人周围神经维持和再生的因素。

　　与年龄相关的损伤的周围神经再生：许多研究表明，周围神经的再生能力随着年龄的增长而下降，但其潜在机制仍然有限。为了更好地了解年龄相关因素对周围神经再生的影响，对两只不同年龄的C57BL/6J小鼠进行了坐骨神经挫伤，平均寿命为24个月。将20个月大的鼠标定义为“大”鼠标，将6个月大的鼠标定义为“成年”鼠标。老年小鼠表现出典型的衰老功能，例如鲸鱼和毛皮。如Semmes-Weinstein单丝试验所示，坐骨神经挫伤后感觉恢复明显延迟。大多数感觉恢复可能是由于侧支的发芽所致，因为在足部区域隐隐神经未受损且神经过度紧张，导致观察到超敏反应。单帧运动分析（SFMA）研究了鼠标底角运动功能恢复的测量，将其作为功能性肌肉的高度重复性标记。老年小鼠表现出运动功能恢复的显着延迟，以及腿部伸展能力恢复的延迟-腿周围神经损伤后运动肾功能的替代指标。实验表明，老年小鼠的功能恢复被延迟，但在周围神经挤压伤后几乎完全恢复。电生理特性进一步反映了功能性神经修复的差异。在压缩部位对坐骨神经的近端和远端进行原位刺激，评估了两组完整和受损神经的组合神经活动电位（CNAP）和神经传导速度（NCV）。挫伤后四周，衰老小鼠的CNAP显着低于成年小鼠，其功能再生轴突的数量减少。老年小鼠的神经损伤显示NCV变慢，髓鞘减少。为了在结构水平评估神经再生，挫伤后4周分析了完整对照和坐骨神经的半薄切片。成年小鼠中受损的神经表现为小的髓鞘轴突，类似于髓鞘轴突且几乎没有巨噬细胞。老年小鼠的轴突较少，直径较小，髓鞘较薄且巨噬细胞较多。相对于轴突直径的髓磷脂厚度的定量显示两组再生神经之间的主要差异，特别是对于较大的轴突直径。对轴突密度，平均轴突直径和髓鞘厚度的研究表明，老年小鼠的坐骨神经再生存在缺陷，并且g比率不会随着年龄的增长而降低。损伤后不同时间点坐骨神经的免疫组织化学染色结果相似。老年小鼠在神经损伤后3天出现延迟的Waller变性，然后延迟了不完全的髓鞘形成。受伤后第4周和第8周，轴突再生对衰老的影响很小。在受伤后第4周和第8周，可以在Remyrin鞘的远端看到这一点。另一方面，可以在损伤后的老年小鼠的坐骨神经中确认轴突再生。观察到的CNAP明显下降。这是由于上述的神经支配不足，也可能是由于来自可溶性靶标的神经营养因子的年龄相关变化。我们的数据显示，神经损伤后4周，老年人周围神经的形态学再生不足。我们假设Schwan细胞功能随着年龄的增长而下降，而不是轴突的独特特性下降，这是老年人外周神经修复能力下降的原因。

　　老年人的损伤反应和炎性微环境的变化：沃勒的变性是有效再生受伤神经的先决条件，包括几种不同的细胞类型，包括巨噬细胞和其他免疫细胞，都是受损神经有效再生的前提。在挫伤前后的不同时间进行IBA-1免疫染色，以鉴定成年人和老年人坐骨神经中的巨噬细胞。老年小鼠的坐骨神经中的巨噬细胞数量似乎增加，这与损伤无关，并且表明老年神经具有慢性炎症微环境。与成年小鼠相比，神经损伤后（3天）老年小鼠的巨噬细胞数量明显减少，但后期巨噬细胞浸润明显过多。这与薄壁部分中显示的数据一致。坐骨神经裂解物的IBA-1免疫印迹证实了这一发现，表明老年小鼠外周神经中慢性巨噬细胞的蓄积量低，并且持续而持续的损伤会引起炎症反应。对挫伤前后炎症微环境中与年龄相关的变化进行了分析，并筛选了成年和老年小鼠神经溶解液中各种细胞因子，趋化因子和急性期蛋白。在受伤和完整的神经中都可以检测到细胞因子表达水平的年龄依赖性变化。损伤后3天，成年小鼠中的表达显着增加，但在损伤后8周被有效下调。损伤后3天，衰老小鼠的细胞因子活性降低，而在8周后，其上调率升高。细胞因子在衰老小鼠中的表达被延迟但延长。在完整的神经中，细胞因子谱的比较证实了抗炎细胞因子白介素4（IL-4），IL-13和IL-27以及促炎性细胞因子单球体的年龄依赖性下调。细胞趋化蛋白1（MCP1）和CC趋化因子配体11（CCL11）的年龄依赖性上调。 抗炎治疗策略：乙酰水杨酸（ASA）抑制哺乳动物的自然免疫反应并减少坐骨巨噬细胞的浸润。为了测试抑制ASA对老年小鼠的损伤诱导的高炎症反应是否可以改善周围神经的再生，在两组老年小鼠中建立了4周的治疗计划。从受伤后3天开始，每2天“ ASA”动物接受低剂量ASA（PBS 10mg/kg）。 “车辆”对照动物仅接受相同量的PBS。使用SFMA和脚趾扩散分析来监测运动功能的恢复，并使用Semmes-Weinstein单丝测试来监测感觉功能以测试治疗效果。 ASA处理对于所有测试参数都具有明显的优势。细胞学分析证实了ASA处理对衰老小鼠4周后持续的炎症反应的抑制作用。细胞因子被下调至未损坏的控制水平以下，包括MCP1和CCL11、在纵断面观察到挤压后4周，ASA对巨噬细胞浸润的影响。巨噬细胞通常用IBA-1染色，促炎性M1和促再生M2巨噬细胞由iNOS和精氨酸酶1鉴定。染色的定量对于（a）总细胞密度（用dapi染色），（b）巨噬细胞总数（iba-1），（c）炎性M1巨噬细胞（iOS）和（d）前体再生M2巨噬细胞很重要。将减少到。炎症减少伴随着髓鞘再生的改善，这是组织切片中髓磷脂蛋白0（MPZ）信号的增加以及整个神经溶解过程中髓鞘碱性蛋白（MBP）的21.5-kDa亚型的髓鞘形成。性上调表现为特异性。经过ASA处理后，pho-erk 1/2略有增加，这也表明了再生能力的提高。此外，电生理测量显示，在ASA治疗的老年小鼠受压4周后，CNAP和NCV升高，但是这种趋势并未达到统计学上的显着水平。 ..我们的数据表明，低剂量ASA治疗后，损伤诱导的炎症反应显着降低，突出了抗炎治疗对衰老小鼠外周神经再生的有益作用。

　　CCL11在体内和体外抑制Schwan细胞的髓鞘形成：着眼于CCL11和MCP1阐明老年人外周神经炎症与髓鞘重构之间的关系继续。随着年龄增长。去神经支配的Schwan细胞表达MCP1、一种有效的巨噬细胞引诱剂。 CCL11、也称为嗜酸性粒细胞免疫细胞趋化因子，由M1和M2巨噬细胞分泌。两种细胞因子在损伤后两天内均在坐骨神经中局部表达。我们已经确定了外植体培养后的局部上调，这支持正常的周围神经修复和炎症的重要作用。高水平的MCP1可能是旧完整的坐骨神经巨噬细胞浸润增加的原因，但是CCL11对老年人外周神经的作用仍不清楚。 CCL11与2、3和5型CC趋化因子受体（CCR）结合。然而，转录组分析几乎未检测到CCR3的表达，CCR3是与嗜酸性粒细胞吸引有关的主要受体，但能显着表达CCR2和CCR5、此外，像配体CCL11一样，CCR5在老年时也被上调。周围神经损伤后，Schwan细胞和巨噬细胞均表达CCR5、并被发现具有明显的上调作用。我们假设CCL11可能直接参与Schwan细胞行为的调节，并在与DRG神经元和Schwan细胞共培养的系统中对其进行了测试。从小鼠胚胎中分离出的DRG在培养基中培养6天，然后在含有CCL11或载体的髓磷脂培养基中培养8天。染色和qpcr用于评估髓鞘的形成。在用CCL11处理的样品中，发现用ΔβMBP作为髓鞘标记物和神经丝重多肽作为神经元标记物的染色显着减少了每个轴突的髓鞘。 QPCR分析显示，在用CCl11处理的共培养物中，髓磷脂标记mpz和mbp的表达显着降低。去分化或增殖标记与其他髓磷脂标记没有变化。这表明CCL11在髓鞘形成中的特殊作用。为了评估CCL11对体内Schwan细胞行为的影响，从单侧坐骨神经挫伤前1周和受伤后4周开始，连续向成年小鼠注射CCL11或载体（PBS）。我受够了。同时，外部完整神经的再生和髓鞘再生。注射CCL11后未观察到巨噬细胞浸润行为的变化。但是，在经过CCL11处理的小鼠中，压缩区的MPZ信号强度倾向于较少的髓鞘再生。髓磷脂碱性蛋白（MBP）的蛋白质印迹分析表明，在CCL11处理的小鼠中，髓鞘重塑的表达显着降低，表明髓鞘重塑的降低。 QPCR分析表明，在坐骨神经损伤后，CCL11和媒介物治疗组的髓磷脂标记mRNA（Mpz，Mbp，Egr2、Prx）显着降低。与受伤的神经不同，两组完整的坐骨神经之间没有显着差异。这表明CCL11对髓鞘再生具有特别大的作用。

　　结论：在完整的神经中存在完整的慢性CCL11时，Schwan细胞似乎进入了连续的去分化的非功能性修复模式，从而损害了周围神经的维持。此外，损伤诱导的CCL11的存在会损害Schwan的再生细胞修复活性和成熟度。我们已经确定CCL11是重要的年龄依赖性炎症诱导循环因子，也是改善老年人周围神经维持和修复的有前途的治疗目标。