动物造模,心脏功能 中国实验动物信息网 2020-09-10 568

　　简介：肥胖是一种全球流行病，与肥胖相关的并发症（例如2型糖尿病（T2D）和心血管疾病（CVD））日益增多。尽管这种增加本质上是多因素的，但众所周知的危险因素包括久坐的生活方式和不良的饮食习惯，例如含糖饮料（SSB）的卡路里摄入增加。  人体无力补偿过多的卡路里消耗会导致许多风险因素和不利影响。研究表明，高SSB摄入量与心脏病发展的许多危险因素有关，包括内脏脂肪沉积增加，甘油三酸酯和胆固醇代谢产物增加以及体重增加。摄入各种碳水化合物（例如糖和果糖玉米糖浆）会导致饮食中的高血糖症，炎症和胰岛素抵抗。此外，增加SSB消耗量会增加血糖和胰岛素水平，直接破坏肝胰岛素信号传导并促进胰岛素抵抗。同样，摄入SSB可能不会引起饱腹感。这可能是水热量增加与健康风险增加之间的重要联系。尽管有证据表明摄入SSB与心血管代谢紊乱有关，但导致这种并发症的潜在机制仍不清楚。通过建立独特的体内实验模型评估SSB的效果。目前的研究调查了3个月和6个月期间，SSB的实际摄入量是否在代谢紊乱和线粒体与心脏功能之间造成了虚构的联系。特别注意了非氧化葡萄糖途径（nogps）的作用，即多元醇途径，己糖胺生物合成途径（hbp）以及pkc在此过程中的作用。这是因为这些途径以前与心血管并发症的发生有关。

　　由于nogps是糖酵解的分支途径，因此它对增加的葡萄糖流量具有上调作用，触发有害的下游途径并引起心脏的收缩功能障碍。动物实验方案：体重不超过250克的雄性Wistar大鼠分为两组：a。给予SSB； b给予纯水；时间分别为3个月和6个月（每组n = 6）。该产品每100毫升含4克稀奶油，每250毫升含176.7 kJ。根据组分配和体重分类，每天以实验剂量通过管饲法给予大鼠。使用表面体积比计算剂量体积并校正重量。这里的剂量模拟了60公斤体重的人每天摄入125毫升（54卡路里）的SSB。每周测量动物食物摄入量，每周称重大鼠，并记录体重增加百分比以评估肥胖的发展。实验步骤完成后，对大鼠实施安乐死，将器官收获，称重，快速冷冻并保存在-80°C直至进一步分析。血液采集：将动物禁食过夜（至少12小时），然后用3％异氟烷镇静，并从右颈静脉采集1毫升血液。使用标准程序将血液离心，取上清液，并评估尿酸，丙氨酸氨基转移酶（ALT），血红蛋白A1C（HbA1c），甘油三酸酯和总胆固醇（mmol/L）的水平。我会。各种方法用于确定糖基化血红蛋白。GSP系统是使用*广泛的系统，结果以糖化率表示。 IFCC方法使用快速液相色谱法分离糖基化和非糖化肽。使用质量分析或毛细管电泳对每组进行定量分析，结果以mmol/L表示。使用回归方程计算EAG。计量单位为mmol/L。要测量胰岛素水平，请使用市售的酶结合免疫吸附测量套件。

　　口服葡萄糖耐量试验：首先，评估空腹血糖水平的基线，将葡萄糖粉溶解在蒸馏水中（0.86 g/kg体重），通过管饲法给药，并监测120分钟。下次以5、10、15、30、45、60和120（分钟）获取结果。线粒体呼吸的研究：如上所述，极谱仪氧气传感器用于在2K氧气分析仪的2 ml玻璃室中测量线粒体呼吸。使用皂苷渗入心肌纤维（约2 mg），置于两个氧气跟踪室中，并在氧气通量稳定时测量内源性常规（R）呼吸。丙酮酸（5 mM），谷氨酸（10 mM），苹果酸（2 mM）用于诱导葡萄糖氧化，辛基肉碱（0.2 mM）和苹果酸（2 mM）用于氧化脂肪酸（FA）。我会指导你的。通过添加2.5 mM ADP，然后添加2.5μM寡霉素，通过抑制ATP合酶来诱导呼吸困难来测量磷（oxphos）。 ..浸入解偶联CCCP（0.5M）以将呼吸增加到*大水平。这称为电子传输系统（ETS）容量。接下来，添加鱼藤酮（复合体I抑制剂）至终浓度为0.5 M，同时添加2.5 M抗霉素A以诱导残留的氧消耗（复合体III抑制）。*后，滴定0.5 mM TMPD和2 mM抗坏血酸，以评估复杂的静脉呼吸作为线粒体含量的代表。将所有呼吸条件下的氧气流量归一化为复合静脉流量，以补偿氧气跟踪室内的细胞含量变化。计算多余的E-R体积，以确定ETS体积和R呼吸之间的差异。

　　心脏功能：实验结束前一周，用1.5-2％的异氟烷将大鼠轻轻麻醉，然后将其放在加热垫上。使用VEVO2100超声系统和13-25 MHz线性阵列传感器进行胸腔封闭超声心动图检查。为了评估左心室舒张功能，在心尖四腔视图中，通过脉冲多普勒获得二尖瓣E和峰值速度，然后计算E/A比。使用超声系统上安装的软件，所有测量均离线进行，平均至少三个连续的心动周期。为了进行灌注试验，用戊巴比妥钠（160 mg/kg体重）麻醉大鼠。快速取出心脏，将其置于冰冷的（4°C）Krebs-Henslate碳酸氢盐缓冲液中，并通过主动脉连接至主动脉套管。左心房也通过肺静脉插管。首先，在恒定的静水压力（100 cmH2O）下对心脏进行逆行灌注10分钟，然后在心脏功能模式下（预加载15 cmH2O，然后再加载100 cmH2O）进行20分钟。心脏没有电起搏，并且心肌温度是恒温器控制并定期监测的（再灌注期间恒定在37°C，缺血期间恒定在36.5°C）。然后将近端左前降支结扎并再灌注2小时，使心脏缺血35分钟。如上所述确定心肌梗塞的面积。

　　心肌脂肪和葡萄糖代谢：使用甘油三酸酯定量分析试剂盒中的皮克探针荧光测量法评估组织甘油三酸酯水平。使用市售试剂盒测量心肌糖原和糖原合酶1水平。

　　结果：体重和器官的变化：SSB组的体重比对照组增加。曲线下面积（AUC）分析显示，SSB组在3和6个月时体重显着增加。两组之间的饲料消耗没有差异，组织重量也没有显着差异（表示为*终重量百分比）。

　　血液代谢产物和OGTTS：禁食后测得的血清水平：尿酸，ALT，HbA1c，胆固醇，甘油三酸酯，葡萄糖。 3个月后，SSB组中HbA1c的检出率升高（与对照组相比，P\u003c0.05），血清胆固醇水平升高。到6个月时，SSB组中的HbA1c（IFCC）仍然升高（与对照组相比，P\u003c0.05），但胆固醇水平没有显着差异。 6个月后，SSB组的尿酸水平高于对照组。 HOMA-IR数据显示，两个实验时间点之间的SSB消耗量没有显着差异。 OGTT数据显示，SSB组在第3和6个月时的AUC低于对照组。线粒体呼吸：结果显示，在6个月时，两组之间的葡萄糖氧化测试的各个参数没有显着差异。丙酮酸，谷氨酸和苹果酸用作氧化底物。当检查过量的E-R比对oxon，LEAK和FA氧化（己内醇肉碱和苹果酸底物）的响应时，观察到相似的结果。 FA氧化物底物的添加显着降低了SSB组的ETS比。由于技术问题，我们无法在3个月内生成呼吸数据。体内和体外心脏功能评估：超声心动图分析显示，对照组和SSB组在3个月和6个月后没有显着差异。心脏灌注数据显示，在模拟缺血后的稳定期和恢复期，SSB治疗组和对照组的参数没有差异。在梗死面积测量中，两组之间没有差异，但在6个月后，SSB组的AR升高。心肌脂质和葡萄糖代谢：评估了几种代谢指标，以更好地了解线粒体呼吸和心脏功能数据。两组之间心脏组织中的甘油三酸酯水平在两个时间点均没有变化。在6个月时，SSB组的心肌糖原水平显着下降，但糖原合酶1水平没有明显变化。

　　结论：总之，SSB摄入分别为3个月和6个月，不会引起心脏功能障碍或IR/T2DM。但是，随着时间的流逝，分子水平的早期变化会使生物体在一段时间内处于较高的风险中，尤其是在压力条件下。