动物造模,二甲双胍,呼吸系统 中国实验动物信息网 2020-09-10 674

　　简介：目前，二甲双胍或盐酸二甲双胍被认为是治疗2型糖尿病的首选药物。它具有许多作用，包括肠道葡萄糖的摄取和胰岛素介导的葡萄糖加工的增加，葡萄糖转运蛋白的转运，肝葡萄糖输出的抑制和脂肪酸氧化。二甲双胍的机制可能由单磷酸腺苷活化的蛋白激酶AMPK介导。更重要的是，二甲双胍可减轻炎症和自身免疫性脑脊髓炎，尤其是通过糖皮质激素屏障保护血管。它用于癌症的预防和治疗以及其他有益作用。相反，二甲双胍的毒性与导致肝脏和肾脏疾病的代谢紊乱有关。它的毒性主要与乳酸酸中毒有关，是由急性和慢性暴露引起的。二甲双胍逐渐被认为是作用于中枢神经系统并可能加速帕金森氏病发作和/或发展的药物。尽管二甲双胍是一种广泛使用的药物，但尚未充分证明其对呼吸系统的作用。血管内皮生长因子*初被描述为血管通透性因子，但它具有许多其他功能。 VEGF-a的表达通常受缺氧诱导物（HIF-1）调节，在哮喘中，AMPK的激活可以调节HIF/VEGF-a途径。血管内皮生长因子-a受体是血管内皮生长因子-1和血管内皮生长因子-2、后者是激酶结构域受体，其是内皮细胞如一氧化氮的细胞生长和血管内皮生长因子。

　　主要负责（NO）和前列环素的产生，血管生成和血管通透性。肺组织富含这种蛋白质，对于肺部结构和功能的发育至关重要。它还对嗜酸性粒细胞增多，粘膜化，气道重塑（皮下胶原沉积），平滑肌增生和超敏反应具有高度抵抗力。重要。此外，在哮喘小鼠中，二甲双胍降低了各种生长因子的表达。我们研究的目的是二甲双胍调节血浆葡萄糖和胰岛素水平的能力，以及炎症细胞和支气管肺泡灌洗液对一氧化氮浓度，肺组织胶原蛋白含量和血管内皮生长因子的影响。这是找出水平。同时，在由出生后营养过剩引起的小鼠肥胖模型中，随时间评估了乙酰胆碱诱导的支气管收缩的肺动力。将小鼠置于22±2℃的温度下，并维持在12:12小时的明暗循环中。免费获得食物和水。肥胖的瑞士小鼠在分娩后通过过度营养获得。动物：在出生的*天，将新生雄性大鼠随机分为每只动物3只（肥胖组）和12只（对照组）。断奶后，所有雄性幼犬均接受正常饮食。在7周龄时，对小鼠称重并进行处理以测量体液摄入量。它分为肥胖组和正常对照组（CC，对照组）。肥胖组是肥胖对照组（OC）和二甲双胍治疗组（OM）。 CC和OC组接受常规饮用水，而OM组则接受二甲双胍（混合物； 300 mg/kg /天）。饲养每只小鼠并仔细监测耗水2周，在治疗期间分别饲养小鼠，并仔细监测耗水2周。通过称量一个水瓶来估计每天的饮水量，并以每天的速度（g饮水量/体重10g）计算这些值。在指定时间结束时，对所有动物称重并计算李氏肥胖指数。这些组用于组织学（生化和组织学参数）或呼吸动力学分析。动物总数为63、

　　生化参数和样品处理：禁食12小时后，使用便携式血糖仪穿刺尾部血管以获得血糖读数。为了测量胰岛素，在吸入麻醉（异氟醚）下对小鼠进行了处理，以获取血液样本。收集血液样本，在4°C下以5300pm离心10分钟，然后保存在冰箱中。要测量胰岛素的血浆浓度，请使用“胰岛素酶结合免疫吸附测量套件”。使用空腹血糖和血清胰岛素水平，使用空腹血糖（mmol/L）x空腹血清胰岛素（MU/L/22.5）计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞和亚硝酸盐/硝酸盐浓度（NOX）：BALF和血液样本来自同一只小鼠。收集血液样本后，将小鼠气管切开以获得灌洗液。在此过程中，将2.5 ml PBS注入气管。用血细胞计数器检测BALF中白细胞（WBC）的浓度，并用三色蓝排除法测定存活率。在Gimza染色的样本中确定了BALF细胞的差异。计数每个样品中至少200个BALF细胞，以评估细胞数差异（％）。通过油脂反应评估BALF，以确定亚硝酸盐/硝酸盐浓度（NOX）。只需将90μL放入96孔板中，然后在室温下与10μL0.7？U/ml的硝酸还原酶孵育3小时。然后将50μl的1％磺酰胺和50μl的0.1％萘乙二胺添加到每个孔中，并在室温下孵育5分钟。用酶标仪测量混合物在540m处的吸光度，并将其与标准亚硝酸盐曲线进行比较。 组织学和免疫组化分析：收集肺泡灌洗液后，收集右肺，用10％多聚甲醛固定并包埋在石蜡中。为了获得总的胶原纤维含量，通过使用厚度为4微米的切片的苦味酸极化法定量分析了肺泡隔（实质）和气道中的纤维含量。 ..肺泡隔和气道分别用常规光学显微镜在200x和400x放大率下测量。对于VEGF-a免疫组织化学，使用7微米厚的切片，脱石蜡并用PBS洗涤。在1％过氧化氢和1％PBS/BSA中培养30分钟后，将1：100抗VEGF-a在4°C下过夜。用PBS洗涤切片，并与生物素化的抗兔1：500和链霉亲和素Western芥末过氧化物酶一起孵育1小时。用PBS洗涤后，在含0.1％过氧化氢的50 mM TBS中与3.3-二氨基联苯胺一起孵育。呼吸动力学：将戊戊比妥钠68 mg/kg，腹膜内和甲苯噻嗪12 mg/kg腹膜内麻醉。小型动物呼吸器用于气管插管和通气（主要通气量为10 ml/kg，120呼吸/ min，呼气正压为3 cmH2O）。注射溴化pan（0.5 ml/kg，i.p.）和曲马莫（50 mg/kg，i.m.）并使用加热垫保持动物的体温。对连接至气道的气管插管施加3 s的振动量扰动，并测量肺系统的输入阻抗（Zrs）。通过将正相模型与获得的数据拟合，可以估算气道阻力（RAW），组织衰减（GTIS）和组织弹性（HTIS）的机械参数。在青少年中，使用超声波装置通过喷洒生理盐水（载体，0.9％氯化钠）和100 mg/ml乙酰胆碱来评估每只小鼠的支气管收缩情况。 15秒后，评估呼吸动力学超过90秒。为了标准化肺体积史，在开始以30 cmH2O的压力输送溶液之前，先对肺充气一次。每只小鼠均从30、60和90年代获得呼吸动力学参数，并以*高决策因子（≥0.85）检查数据。实验结束时，在麻醉下处死动物。 结果：通过体重和Lee指数评估模型诱导肥胖的有效性。与CC组相比，OC和OM组的这些参数已显着增加（p\u003c0.0001）。二甲双胍治疗没有减轻体重，也没有恢复OM组的Lee指数。与CC组相比，两个肥胖组的血糖，胰岛素水平和HOMA显着增加。 OC组的血糖水平高于CC组（P\u003c0.005），而OM组的血糖水平高于CC组。这些结果提供了代谢综合征建立的证据，二甲双胍治疗不能修复代谢障碍。对于BALF炎性细胞，与CC组相比，OC组的白细胞和泡沫细胞显着增加。与CC和OC组相比，OM组的白细胞恢复到与CC组相似的水平，但OM组的泡沫细胞减少。对于巨噬细胞，与CC组相比，发现OC明显降低。但是，与CC和OC组相比，OM巨噬细胞增加了。每组淋巴细胞的比例没有变化，每组的NOX值相似。与CC组相比，OC组和OM组气道的总胶原含量增加。但是，与对照组相比，二甲双胍治疗不能修复气道。肺泡室的胶原蛋白含量没有差异。与CC组相比，OC组中VEGF-a的数量显着增加。 OM组的血管内皮生长因子A水平降低，但与CC组的差异有统计学意义。因此，结果表明，二甲双胍不能完全恢复CC组基础水平的肺血管特性。在30、60和90年代喷洒生理盐水和乙酰胆碱后，记录肺的机械参数。与CC组相比，肥胖组（OC和OM）在吸入乙酰胆碱30秒后显示出明显的支气管收缩。 Metoformin治疗未能阻止30岁的肥胖小鼠对乙酰胆碱的早期加重反应。在60年代和90年代，所有组对乙酰胆碱的反应相似。在30、60和90秒时，所有组喷洒的乙酰胆碱的GTI水平高于喷洒的生理盐水的GTI水平。没有观察到HTIS值的变化。

　　结论：产后营养过剩导致小鼠肥胖血浆葡萄糖和二甲双胍的胰岛素水平的改善是有限的，并且对氮氧化物没有显着影响。此外，二甲双胍不能改善BALF巨噬细胞，而肥胖小鼠的血管内皮生长因子和总胶原蛋白水平降低。尽管有这些改进，使用乙酰胆碱诱导肥胖小鼠的支气管收缩以评估该药物对肺功能的修复效率已显示非常低效。这项研究表明二甲双胍不会促进整体肺部改善。但是，为了确定二甲双胍对肺部的影响，有必要研究不同的动物肥胖模型和代谢综合征的不同阶段。