动物实验,出血性中风,缺血性中风 中国实验动物信息网 2020-09-09 762

　　背景：中风可分为出血性中风和缺血性中风，随着全球人口老龄化和社会压力的加剧，这种疾病的发病率不断增加。早期溶栓治疗缺血性中风是当今已经确立的程序，但是当对出血性中风患者进行溶栓治疗时可能是灾难性的。目前，计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）被用于区分出血性脑卒中和缺血性脑卒中。在缺血症状出现后立即使用溶栓治疗可以产生令人满意的结果。然而，不建议在症状出现后4.5小时以后采用这种治疗，因为它的潜在益处并不超过出血并发症的风险，而出血并发症随着时间而增加。缺血性症状出现后的大部分时间都浪费在往返诊断仪器和影像学检查上，因此，只有整个卒中人群的1-8%接受这种治疗。这一临床挑战促使开发新的和简单的院前方法，可以区分缺血性和出血性卒中彼此。多年来，人们开发了几种区分缺血性和出血性脑卒中的技术。多普勒超声可以准确地识别大脑动脉的状态（例如，狭窄、阻塞、抽搐或缺血），但是它不能排除出血性转变从产生的缺血区域。电阻抗断层扫描（EIT）已被提出作为检测脑出血（ICH）的动物模型的可能技术，并且阻抗谱被建议作为检测男性中风相关脑不对称性的方法。然而，EIT需要通过电极-颅骨接触注入电流，这可能降低检测精度。此外，电流很难通过超高电阻率颅骨，因此可能严重降低成像质量。近红外光谱（NIRS）检测出血性中风，因为血红蛋白比其他组织吸收更多的近红外光。然而，这种方法只能检测头皮下2.5cm以下体积大于3.5ml的血肿。同一类型的仪器鉴定出28例儿童出血患者，敏感性为100%，特异性为80%，但未能检测到深部或早期出血。微波技术依赖于血液和其他组织之间存在显著的介电对比。微波方法可以区分出血和缺血性卒中以及出血和健康状态的区别。然而，这种技术对于天线和出血部位之间的位移非常敏感。此外，微波在大脑中的衰减远大于磁场。因此，微波对深部出血不敏感。MIPS技术是基于电磁感应原理，测量感应磁场（IMF）对激励磁场（EMF）的相位摄动。相位扰动与测量对象的电导率成正比。电导率的变化可以通过MIPS技术检测。出血和缺血均伴有颅内组织体积和组成的变化。考虑到这些变化随后会引起整个脑电导率的变化，MIPS技术能够识别大脑中的病理状况。出血和缺血是相反的病理状态。出血是实质血管破裂引起的出血。在早期，出血减少脑脊液（CSF）。当脑脊液代偿机制结束时，增加的出血量将显著增加颅内压（ICP）。脑缺血是指某一区域缺氧、缺血等疾病。?缺血性中风可以是血栓型，其中病变或受损的大脑动脉被阻塞或栓塞，并且血栓（栓塞）形成于脑本身以外的地方。缺血引起大量神经元坏死，导致梗死。长时间缺血后，坏死组织不能恢复。电导率随脑组织类型而变化，从脑脊液和血液下降到灰质和白质。此外，当细胞处于不同的病理状态，如坏死、水肿时，电导率会发生变化。在这种情况下，MIPS技术可以反映组织状况。国外对MIPS脑病检测方法的研究还停留在物理模型和仿真实验的水平。本课题组长期从事脑出血、脑缺血、脑水肿的MIPS检测研究，并开展了大量的动物实验。实验结果表明，随着出血量的增加，MIPS逐渐减少。本实验设计了一种新型线圈结构，并用于测量家兔出血或缺血后MIPS的变化。在MIPS技术中，被测物体总是放置在发射线圈和接收线圈之间，发射线圈中的电流流会引起初级磁场。这个初级磁场随后在物体中引起涡流，从而产生次级磁场。初级场和次级场均由接收线圈检测。

　　检测线圈：实验中使用了两个相同尺寸的方形线圈（一个发射线圈和一个接收线圈）。两个线圈均由25圈铜线制成，在侧长r=100mm的正方形塑料上轧制。线圈直径d=180mm。发射线圈产生穿过测试对象(红球)的EMF(实线)，该EMF(实线)又产生IMF(虚线)。接收线圈接收部分EMF和IMF。接收线圈之间距离大，只能接收一小部分电磁波。方形线圈可以在两个线圈之间产生具有均匀灵敏度的区域。实验确定了该线圈组在空载条件下的谐振频率为14.8MHz。当将兔头置于线圈结构中时，谐振频率偏移到16.4MHz。当工作在这个频率时，磁场强度和MIPS灵敏度都达到*大。因此，选择16.4MHz的频率用于所有实验。

　　实验装置：使用AFG3252任意波形发生器作为信号源。该发生器输出两个具有相同频率和相位的信号通道。一个幅值200mVPP的信号被输入到射频仪表功率放大器。该放大器的带宽范围从0.5MHz到1000MHz，输出功率为+35dBm，典型的高增益为38dB。 来自接收线圈的输出信号连接到PCI5124的另一个输入端口。兔子被放置在一个聚氯乙烯平板平台上，这个平台可以上下、左右和后退。在测量之前，重新调整平台的高度和水平位置，将兔脑精确地放置在两个线圈之间。利用LabVIEW软件编制了基于FFT算法的相位差测量程序。该程序用于测量PCI5124采集卡的两个输入信号之间的相位差。采样率设定在100M/S，采样点数为100万个。根据缺血时间或注射量记录该阶段的变化。

　　实验动物：随机选取20只新西兰兔（体重2.0～2.5kg），分成两组，出血和缺血组（每组n=10）。为了减少杀戮和保持一致性，两组在输血或结扎前2小时测量了4只动物。输血或结扎前数据作为对照组。

　　出血手术：考虑到颅内出血主要发生在内囊，我们采用自体血注入右囊后肢的方法建立内囊出血模型。本研究的操作程序与先前的研究相似。兔耳静脉注射氨基甲酸酯（25%，5ml/kg）麻醉。实验组在*次麻醉完成后不追加麻醉药，因为测量时间不超过2h。对照组在术后2h加用3ml氨基甲酸酯（25%）。结果，在兔头的正中部做了纵向切口，暴露了前囟孔和冠状缝。. 在冠状缝前方1mm，距中线6mm处钻一个孔（d=1mm）。使用肝素化注射器从后肢皮下静脉提取总共2毫升新鲜自体血。将塑料管(d=0.7mm)引入适当的深度(H=13mm)。手术后，兔子被固定在平台上。调整了兔子的位置，使它的大脑准确地位于两个线圈之间。然后连接测量系统。使用注射器泵，以恒定速度(1ml/h)向内囊注射1ml自体血。实验装置同时测量了MIPS。以输血前的数据作为基线数据。测定完毕后，将1.5mol/l的KCL溶液注射到兔耳静脉中处死兔。

　　缺血手术：采用双侧颈动脉永久结扎法建立缺血模型。兔耳静脉注射氨基甲酸酯（25%，5ml/kg）麻醉。在麻醉状态下，对家兔的颈部进行脱毛和消毒。随后，中颈部皮肤被切开并钝性解剖以暴露和分离双侧颈总动脉，该双侧颈总动脉用两条1mm厚的尼龙线打结，但不结扎。手术结束后，将兔头固定在平台上，置于两个线圈之间。一旦系统稳定，双侧颈动脉紧密结扎，然后同步测量MIPS 2小时。1ml 1.5mol/l的KCL溶液注射到兔耳静脉中处死。

　　结果：用小波分解对每组动物数据中的呼吸和心跳信号进行滤波。对于缺血组和对照组各动物的结果，将缺血2-h的MIPS数据平均分成42个连续部分。然后确定各部分的平均值。这种处理方法实质上等价于在每2.85分钟获得一个MIPS数据。然后对所有组动物数据进行平均，测定标准差（SD）。对于出血组各动物的结果，将注射1h的MIPS数据平均分成21个连续部分。然后确定各部分的平均值。这种处理基本上相当于每2.85分钟或每0.047毫升注射一次获得MIPS数据。然后对所有组动物数据进行平均。图5显示了X轴表示测量时间的结果，而Y轴表示MIPS数据。每组数据为所有相关组动物的平均值。每个来自出血组的动物数据不注射相对于基线数据。缺血组的数据在结扎前为基线数据。对照组的数据也相对于初始数据进行归一化。经统计学处理，两组比较有显著性差异。

　　结论：脑缺血是临床上的一个重要问题，当被当作出血治疗时，会引起严重的后果。本研究采用基于MIPS技术的新型线圈结构来区分缺血性脑卒中和出血性脑卒中。采用两种脑卒中动物模型，测量表明MIPS随出血量的增加而逐渐减少，但随着缺血时间的延长而增加。两种脑卒中引起的MIPS变化趋势完全相反，出血组和缺血组MIPS变化的绝对值明显大于正常对照组。这两种脑卒中引起MIPS改变的机制不同。前几章的分析表明，早期出血时MIPS的减少是由脑脊液的调节作用引起的，而MIPS的变化主要是由早期出血时组织的体积变化引起的。缺血引起的MIPS升高是组织成分变化的结果。在高频下，MIPS的增加主要是由组织中总离子含量的变化引起的。随着缺血时间的延长，组织内代谢产物的积累增加，导致阻抗减小，MIPS增大。各组动物结果的一致性较低，主要是因为不能保证兔头在两个线圈之间的放置完全一致。所使用的样品之间的个体差异(例如，重量)可能是一致性低的另一个原因。一般来说，这只是一个初步研究，以验证这种方法的可行性，以区分两种类型的中风。根据实验结果，两种行程的测量灵敏度较低，需要改进线圈系统。其次，实验装置还需要改进，以提高精度。应该制作一个动物定位装置以保持实验中所有动物的一致性。此外，还应努力建立更符合临床的脑出血和缺血模型。