动物实验,角膜炎症 中国实验动物信息网 2020-09-08 538

　　简介：干燥性角结膜炎是一种病理性疾病，通常称为干眼，其特征是泪液分泌量和质量的改变。临床表现为感染、刺激、溃疡、视力模糊。干眼症患者眼表完整性受年龄、气流、紫外线、温度、化学成分、湿度、激素等多种因素的影响。所有这些变化都产生诱发炎症和氧化应激的自由基。报道的文献证实，泪液含有多种抗氧化剂，如乳铁蛋白、酪氨酸和谷胱甘肽，它们保护角膜上皮细胞。眼表泪液缺乏及脱水导致干眼综合征。因此，干眼症引起的角膜溃疡的炎症和氧化应激增加。因此，抑制这些因素的药物可能是治疗干眼症的一种治疗选择。雌激素及其衍生物具有较强的抗氧化和抗炎作用。Hiji等人的研究证明，2-羟基雌二醇能显著降低干眼症大鼠模型的炎症和氧化应激。已知异黄酮具有较强的抗氧化和抗炎活性，而且大豆苷元和染料木黄酮等异黄酮具有与雌激素相似的作用。近年来，许多药用植物及其代谢物被用作治疗多种抗生素和治疗剂的替代品。文献表明，大豆苷元根据其抗氧化和抗炎作用，用于酒精依赖和神经退行性疾病的治疗。大豆苷元通过抑制NF-κB和STAT-1的激活抑制炎症介质。本研究调查了大豆苷元在干眼症治疗中的作用。

　　动物：健康雄性Wistar大鼠（250～300 g）在8周龄时用于本研究的药理筛选。大豆苷元清除自由基活性的评价：根据先前报道的电子自旋共振研究进行酪氨酸自由基的估计。本研究中所用的混合物PBS （pH 7.4）乙醇中含有5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO，100 mM），H2O2和肌红蛋白（400μM）. 将所有的甾醇倒入上述给定的反应混合物中，然后加入H2O2开始反应。室温下进行ESR光谱。

　　大豆苷元对PGS活性的影响：利用人角膜上皮细胞株CEPI-17-CL4评价大豆苷元对细胞活力的影响，以进一步估算大豆苷元的浓度。HCG补充的培养基用于培养96孔板中的CEPI细胞。将CEPI细胞与大豆苷元在培养基中孵育一天。用含有10%的阿拉玛蓝新鲜培养基来代替原培养基。该试剂用于细胞存活率的估计。孵育一小时后，测定。PGS抑制活性的评价证实了儿茶酚类药物的抗炎活性。用CEPI细胞提取液对大豆苷元的PGS抑制活性进行评价。用含有DTT和EDTA 的 Tris buffer（5mM, pH 7.4）将CEPI细胞均匀化， 10000 rpm持续5分钟。用COX荧光活性测定试剂盒测定PGS活性。用荧光法测定COX1和COX2酶的活性。

　　大豆苷元对干眼症的影响：用干眼症大鼠模型评价大豆苷元的作用。将大鼠麻醉，取泪腺，制作干眼症大鼠模型。泪腺摘除后第1天开始实验，大豆苷元采用0.1、1、10μM的浓度。在10、0.1、1、10μM的PBS中，制备了浓度为10mM的大豆苷元。每只大鼠每天给药5μl的大豆苷元，持续2周，每日四次，对照组泪腺摘除大鼠给予赋形剂。治疗结束后评价泪液量和荧光素评分。此外，用荧光素染色眼表，评价干眼的程度。角膜照片被分成九个不同的区域，根据染色的程度，每个区域的得分在0和3之间。每个区域的得分加在一起，得到总分，称为荧光素得分。气流、温度、湿度等因素是多种多样的。以正常大鼠评分为参照。从整个组的角膜中分离总RNA进行实时PCR。用TrIZOL从角膜中提取总RNA，并进行反转录。采用RT-PCR法检测血红素氧合酶、TNFα、白细胞介素6（IL-6）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和PGS-2基因的表达。用COX荧光活性测定试剂盒测定正常组和对照组角膜提取物中的PGS活性。

　　结果：大豆苷元清除自由基活性的研究：ESR研究表明，酪氨酰自由基的ESR信号被1mM酯类二醇和1mM的大豆苷元减少。此外，0.3～0.5mM的大豆苷元也显著降低了信号.

　　大豆苷元对PGS活性的影响:10uM时，细胞存活率高达90%，此后浓度进一步升高，细胞活力明显下降。10uM,的大豆苷元对PGS活性有明显的抑制作用。然而，本研究中使用的其他类固醇没有改变PGS活性。因此，基于其清除自由基活性和抑制PGS活性，大豆苷元被用于治疗干眼症。

　　大豆苷元对干眼症的影响: 荧光素染色的角膜照片显示PBS处理的荧光素染色面积与大豆苷元处理的面积相比更大。荧光素评分也观察到了这项研究。治疗组大鼠荧光素评分明显高于正常对照组。与赋形剂对照组相比，大豆苷元的治疗显著降低了评分。泪液分泌的结果表明，治疗组在泪腺摘除后泪液分泌减少约45%，泪腺分泌物减少后，泪液分泌减少。无泪腺的大鼠泪液分泌减少，角膜脱落。与正常对照组相比，干眼症患者的荧光素评分显著升高。结果表明，干眼PGS活性高于正常侧。此外，大豆苷元与干眼相比显著抑制PGS活性。

　　讨论：本研究评价了大豆苷元对干眼症大鼠模型角膜的保护作用，并初步探讨了大豆苷元的作用机制。通过去除泪腺建立干眼症大鼠模型。各种报告表明，该模型用于干眼症的诱导是简单的，没有化学诱导干眼。文献表明，在干眼中，角膜细胞中IL-6、MMP9和PGS2的表达增加。大豆苷元抑制IL6和MMP9的表达，，Id6和MMP9的表达增加。这些结果表明，大豆苷元改善干眼症。大豆苷元不影响PGS2在CEPI细胞中的表达。这表明在细胞提取物中大豆苷元是从PGS中分离出来的。因此，本研究认为大豆苷元通过竞争抑制PGS的活性。其对酪氨酸自由基的影响也在调查中进行了评估。观察到大豆苷元具有酪氨酸自由基清除活性，酪氨酸自由基对PGS活性起重要作用。因此，酪氨酸自由基清除剂与PGS抑制剂之间存在一定的关系。这意味着大豆苷元在其酪氨酸自由基清除活性的基础上抑制PGS活性。大豆苷元对干眼症大鼠泪液分泌有部分恢复作用。这些效应可能是由于眼眶内泪腺分泌增加或眼表潴留得到恢复。

　　结论：本研究的结论是，大豆苷元通过抑制炎症和氧化应激保护干眼症大鼠模型的角膜。