动物实验,血管内皮细胞,索拉非尼,肝细胞癌 中国实验动物信息网 2020-09-05 1126

　　简介：肝细胞癌（HCC）是世界上第二大导致癌症死亡的主要原因，肝脏被认为是血源性肿瘤转移的*常见部位。局部治疗（TACE）被认为是晚期肝癌的有效治疗方法。这些治疗仅维持病变的短期稳定性，并且提供有限的存活益处。血管内皮生长因子（VEGF）是*有效的肿瘤血管生成调节剂之一。在局部治疗肝癌后，其显着增加，并且被认为是肿瘤存活和复发的重要因素之一。到目前为止，抗血管生成多激酶抑制剂索拉非尼抑制Raf丝氨酸激酶和受体酪氨酸激酶（如VEGFR-2、PDGFR-β，c-KIT，FLT-3和RET）的活性，它导致肿瘤细胞生长和血管生成的抑制。已经证实索拉非尼在BCLCC期肝癌中的疗效。然而，索拉非尼治疗后6.5个月，局部反应为3.3％，出现耐药性。在解释病情时，具有门静脉肿瘤血栓的BCLC C期还不够全面（PVTT），并且在此阶段尚不能清楚地区分原发性或分支性门静脉肿瘤血栓。在门静脉癌的治疗中已经证实了肝动脉化学栓塞的安全性和有效性。其实，两种疗法对TACE都没有明确的禁忌症？ +？大多数接受B和C期联合治疗的患者，例如索拉非尼，预后较好。回顾性研究表明，TACE联合索拉非尼对晚期HC患者有益。同时，发现不同的研究使用了不同的方式和给药时间。显然，这些差异可能在这些试验中引起争议。在这项研究中，动物研究被用来研究索拉非尼联合治疗的*佳起点。方法：肿瘤细胞和动物：Walker-256肿瘤细胞，4周龄的BALB/c裸鼠（12-15g，N≥2）将肿瘤细胞注入大腿外侧。 ..给成年雄性SD大鼠（体重150-200g；N≥50）接种肝内肿瘤。将动物置于SPF条件下，温度为23-±3°C，相对湿度为50-±10％。皮下肿瘤模型的建立：使用Walker256肿瘤细胞建立肝肿瘤模型，然后建立磷酸盐缓冲盐水（PBS，16.5mM磷酸盐，137mM氯化钠和2.7mM氯化钾，pH 7.4）。 ）被使用。将肿瘤细胞悬液稀释至107细胞/ ml，并皮下接种在BALB/c裸鼠的大腿外侧。肿瘤细胞接种后约9天，在注射部位可见直径约1 cm的皮下肿瘤。肝癌模型的建立：使用上述方法进行肿瘤移植。从供体动物皮下收集肿瘤，切碎，通过小腹中线切口打开SD大鼠，并以10mg水合氯醛以300mg/kg的剂量腹膜内麻醉。肝的左叶在腹腔外延伸。使用眼科镊子，准备大约2-3叶厚的囊下隧道深度。将实体瘤块插入隧道。用一小块明胶海绵覆盖伤口。止血不是必须的，所有实验大鼠在手术后恢复正常并在第二天恢复正常活动。实验治疗：移植后十天，使用磁共振成像（MRI）评估肝肿瘤模型的建立。通过腹膜内注射水合氯醛麻醉实验动物，然后进行MRI扫描。扫描参数为：回波时间：T1WI为82ms，T2WI为1.5ms，重复时间T1WI为1500ms，T2WI为508.7ms，T1WI和T2WI的重构厚度为5mm。将40只合格的患有肝肿瘤的大鼠随机分为四组。 A组为对照组，仅向动物注射VEGF（20 mg/L，1 mL/kg，体重）。在VEGF注射前72小时，用索拉非尼（100 mg/kg bw）对B组（B组，n = 10？）进行管饲。 C组（C，n≥10）接受强饲索拉非尼和血管内皮生长因子注射。 D组（D，N = 10 -4）在注射血管内皮生长因子后72小时通过管饲法接受索拉非尼。索拉非尼连续100天每天口服一次，剂量为100 mg/kg体重。重组大鼠VEGF165（每管20 mg）以1000pm离心30秒，溶于100 ml去离子水中，并用所需浓度的盐水稀释。 B，C和D组的大鼠注射20 mg/LVEGF。影像和病理学研究：磁共振成像用于评估肿瘤和腹水的发展。在索拉非尼治疗后10天，确保肿瘤组织的肝移植并监测肿瘤和腹水的发展。在肿瘤快速发展的情况下，通常每天根据皮毛，营养摄入和行为对动物进行评估。动物死亡后，对大鼠肝组织标本进行分析并比较MVD和VEGF。我们使用了兔抗小鼠VEGF多克隆抗体和兔抗小鼠CD34抗体。血管内皮生长因子和微血管检测与计数：两位资深病理学家将分别确定每张玻片上的血管内皮生长因子蛋白表达和MVD水平。在每种情况下，计数100个上皮细胞，上皮细胞为阳性，计数5个随机点并计数染色的上皮细胞。使用平均CD34阳性微血管计数检测肿瘤血管。在光学显微镜下，毛细血管染色数量*多的五个区域被确定为“热点”。为了量化微血管，使用200倍放大视野对五个“热点”进行计数并取平均值。它不计入坏死或炎症区域。进一步分析排除了五个无法识别的“热点”。如果两位病理学家之间存在显着差异，请再次检查直至达成共识。结果：检测肝脏中的肿瘤生长：在肿瘤组织移植后十天，MR常规扫描被用于确定SD大鼠的肝脏是否患有肝肿瘤。记录肿瘤的大小和位置。除腹壁或腹腔内的肿瘤外，将发现的肿瘤进行以下实验：索拉非尼给药10天后，MR扫描用于测量肿瘤大小。*大肿瘤直径用作评估指标。

　　平均生存时间：A，B，C和D的平均生存时间为19.6±±1.78、31.2±±6.99、27.4±±4.9和26.5±±4.6天。结果表明，索拉非尼组与对照组之间的生存时间存在显着差异。 B组和D组之间存在显着差异。但是，B和C组与C和D组之间没有统计学差异。病理检查：在实验动物自发死亡后，取肝肿瘤标本进行HE染色。如图所示，正常的小叶结构消失了，肿瘤细胞呈片状或巢状排列。肿瘤细胞核有丝分裂的频率很高。肿瘤的非典型细胞很明显，是双核甚至多核的。可以看出，大的嗜酸性斑块是肿瘤坏死的区域。 4组之间的肿瘤形态无明显差异。与索拉非尼组相比，对照组的肿瘤细胞更小，更紧凑，并且在大小和形状上有更大的变化。免疫组织化学：肝癌中的VEGF表达呈棕褐色，主要分布在细胞质中。在对照组中，通过免疫组织化学检测到大量的VEGF阳性血管内皮细胞。对照组中VEGF阳性细胞样品的数量为88.3±13.61、比B，C和D索拉非尼组分别高42.8±7.96、71.9±15.73和73.6±13.73、 B组和D组之间的VEGF表达逐渐恢复，表明索拉非尼的早期给药具有更明显的抑制作用。 CD34阳性细胞染成棕色或深棕色。四个MVD组的趋势与VEGF相似。对照组和索拉非尼组之间存在统计学差异。平均生存时间与肿瘤的关系：VEGF和MVD通常用于评估肿瘤的血管生成活性。这些是一致的，相关系数为0.875、为正。使用Pearson的连续变量相关分析，VEGF与平均生存时间之间的Pearson系数的乘积矩相关性为0.78，为负值。 MVD与平均生存时间呈负相关（0.794）。结论：施用索拉非尼*合适的解决方案是在增加VEGF表达之前通过抑制VEGF和VEGF受体表达来控制肿瘤的生长，从而延长实验动物和肿瘤的存活率。