动物实验,动脉粥样硬化 中国实验动物信息网 2020-09-04 802

　　背景：动脉粥样硬化及其并发症是大多数国家的主要死亡原因。虽然许多全身性因素，包括糖代谢异常、高脂血症、高血压和吸烟，被鉴定为危险因素，扰流更可能发挥了举足轻重的作用，在动脉粥样硬化的发生发展中具有一种非随机优先模式，其特征是分支或弯曲动脉壁的低切应力和振荡壁面切应力（SS）。越来越多的证据表明，SS是血管损伤发生的罪魁祸首。。随着血管内超声（IVUS）和计算流体动力学的应用，研究人员证明SS可以用于预测支架内再狭窄引起的内膜形成和评估球囊血管成形术后血管重建的进展。研究表明，高SS与支架内再狭窄和靶病变血运重建有关，即使在成功的球囊成形术中也是如此。然而，球囊扩张术后新生内膜增生与新生内膜增生的关系有待进一步证实。血管内皮细胞（EC）是内衬血血管壁的重要组成部分和直接暴露于紊乱血流。同时，内皮细胞可能受到各种化学和机械刺激的影响，*终调节体内平衡功能。EC功能障碍是血管疾病，包括动脉粥样硬化和血栓形成的一个重要病理因素。近年来，已经建立了多种体外模型来调节内皮细胞的剪切流动，目的是模拟体内内皮细胞流动环境的特征。这些模型帮助研究人员探索其对SS的反应机制，包括对EC形态、细胞骨架组织、增殖、迁移、通透性和连接蛋白、EC信号和基因表达的影响。多项研究探讨了SS对血管结构的影响。然而，SS在血管重塑和新生内膜形成中的作用还没有完全阐明，尤其是体内的扰动流动。应该建立一个适当的模型来探讨这个问题。因此，我们用一个圆筒形的套管将家兔接受腹主动脉缩窄术。它模拟动脉粥样硬化引起的狭窄的血流动力学特征，探讨球囊损伤后SS对血管重塑的影响。我们假设，这种收缩性血管模型，类似于动脉粥样硬化斑块，会在收缩血管的上游和下游引起不同程度的内膜增生，不论是否伴有球囊损伤。

　　方法：动物：40只新西兰白兔，体重2.2–2.6 公斤，雄性，随机分为5组（n = 8  每组），单笼饲养，自由采食和饮水，术前至少适应1周。兔用3%戊巴比妥钠麻醉（1 毫升/公斤）然后右股动脉插管四导引鞘所有导管随后通过鞘引入腹主动脉。。肝素钠（200 IU/kg）是动脉内注射。，正中矢状切开肾动脉和髂总动脉血管 中间约1厘米长的分离，等待下一步的分组决定。每只家兔取腹主动脉作基线血管造影和IVUS检查。所有操作均处于无菌状态。

　　手术操作：组1，仅损伤主动脉球囊，刚好位于分离动脉的上游，并以手术缝合而不结扎作为对照。。组2，不仅球囊损伤主动脉，动脉也在分离动脉的上游。用圆筒形套管也部分收缩了孤立的动脉（直径约2 毫米，长度5 毫米）外科缝合结扎。组3：仅损伤主动脉球囊在分离动脉的下方，并以手术缝合而不结扎作为对照。组4：损伤主动脉球囊，位于分离动脉的下游，用圆筒形套管部分隔离狭窄的动脉，由外科缝合线结扎。组5：仅用外科缝合线连接的圆筒形套管部分分离狭窄的动脉。在球囊扩张损伤水平，主动脉的扩张率为1.2和1.3之间，根据基本IVUS直径的数据在10间隔两次在同一地点，记录数字减影血管造影（DSA）和IVUS图像。术后无菌缝合切口，静脉注射抗生素预防感染。动物被允许恢复正常饮食。四周后，用DSA和IVUS检查家兔。过量戊巴比妥钠安乐死，主动脉从肾动脉解剖至髂分叉，用10%中性甲醛灌注固定过夜。固定的主动脉嵌入石蜡块进行形态计量学和免疫组织化学研究。

　　形态：从两个不同的部位，即收缩动脉和假动脉的上游和下游部位获得横截面。标本切成连续5 μm截面一般组织学染色与苏木精-伊红（HE），Image-Pro Plus 6图像分析系统测定管腔面积和内弹力层面积和新生内膜面积、。对相应节段的平均面积（N = 3）进行统计分析。

　　免疫组织化学：切片脱蜡和水化，切片在PBS 3%过氧化氢处理10 min 抑制过氧化物酶的活性。抗原修复是用柠檬酸盐缓冲液（pH 6）。4°同CD31单克隆抗体孵育过夜。PBS冲洗后，切片与羊抗鼠IgG室温，孵育20 min ，后同SABC复合物孵育再次PBS冲洗，DAB染色，苏木素复染中，脱水，和固定。对照组执行同样的程序，其中主要是由非免疫血清抗体进行更换。

　　结果：家兔模型的建立：实验四只兔（组2两只，组3和组4各1只），在实验过程中因过度麻醉、血栓形成、失血性休克、球囊损伤而死亡，其余兔子全部完成研究。基线平均体重2.36±0.25公斤 ，四周后体重3.14±0.16 公斤。五组间体重无显著差异，提示模型成功建立。评估血液动力学证实部分腹主动脉缩窄后血管SS的改变。对这些常规测量进行评估，以确定变SS模型。

　　狭窄的上游SS减轻球囊损伤后管腔的丢失：四周后，用血管内超声测量分离动脉的上、下游血管直径，以评价球囊损伤和/或狭窄的血管重构。在分离动脉的上游，与其他三个无球囊损伤和/或狭窄组相比，球囊损伤显著降低球囊损伤组管腔直径和球囊损伤组。此外，动脉收缩并没有导致球囊损伤继发的内径的进一步减少，反而减弱了上游血管管腔的丢失。同时，与其他组相比，单动脉狭窄与正常血管相比，血管直径无明显变化。在分离动脉下游，单球囊损伤可显著降低组3管腔直径，提示收缩导致的组2和组5正常血管管腔扩张. 此外，球囊损伤使扩张的趋势越来越明显，组4造成血管腔有过度扩张。

　　狭窄的上游SS诱导正常血管内膜增生，减轻球囊损伤后的增生：术后四周通过形态学和定量评价内膜增生程度。在分离动脉上行，类似于IVUS，组1与组2与其他不受IU球囊损伤组比较球囊损伤后新生内膜面积明显增加。组2与组1相比，动脉收缩引起的血流动力学变化并没有加重球囊损伤继发的内膜增生但抑制内膜增生组。在分离动脉下游，简单的收缩会导致下游动脉有明显的新生内膜增生组，但管腔直径随血管内超声的增加而增大。然而，在组4收缩不加重内膜增生而导致内膜几乎完全消失. 与其他各组相比，管腔内径扩张过度。

　　狭窄的上游SS加速球囊损伤后再内皮，但与下游SS的效果相反：探讨低ESS对损伤血管再内皮化的影响，在CD31抗体免疫组化染色后检测血管内皮细胞标志物（CD31）。管腔表面覆盖的CD31阳性细胞数计算再内皮化，观察到沿血管壁的腔面为CD31阳性染色。上游SS加速球囊损伤动脉再内皮化，下游SS对损伤内皮细胞的修复有抑制作用。

　　结论：适当的低单向SS有利于血管成形术后内膜增生的抑制，是支架狭窄的一个潜在的治疗靶点。