动物实验,胃黏膜缺损 中国实验动物信息网 2020-09-04 639

　　背景：胃粘膜屏障是一个复杂的系统，涉及物理、化学和生物防御机制，保护胃免受刺激性食物、盐酸和胃蛋白酶活性的影响。几个条件，如胃炎、胃黏膜糜烂和溃疡，可破坏胃粘膜屏障导致其损坏。胃粘膜损伤是兽医学中常见的疾病。由于许多经常使用的药物，如非甾体抗炎药或糖皮质激素。有几种疾病可以破坏粘膜的防御机制包括幽门螺杆菌感染、肝脏或肾脏疾病，肾上腺皮质功能减退症、休克、脊髓疾病、自身免疫性疾病，原发性胃肠道疾病和肿瘤。因此，胃或十二指肠溃疡通常是由于胃粘膜或十二指肠上皮屏障功能缺陷引起的。胃溃疡被描述为胃粘膜上的一个巨大的“月亮坑”缺陷。内窥镜研究显示，48.5%的犬在胃或十二指肠近端有溃疡。胃癌与其他家畜相比，在胃癌中也很常见，因为肿瘤切除会导致胃深部伤口，需要进行组织重建。大多数胃恶性肿瘤是癌，占50 - 90%。其次是肉瘤和恶性淋巴瘤。一些研究试图移植胃粘膜缺损。羊膜是一种很有前途的新型生物材料。AM是胎膜*内层，除了胶原海绵IV、V和VII外，还有一层上皮细胞，除了含有间充质细胞的纤维粘连蛋白和层粘连蛋白外，还有一层较厚的基底膜。AM以其低免疫原性被认为是同种异体移植的理想组织。在同种异体移植过程中，AM具有抑制T淋巴细胞的能力。AM作为基底膜，促进上皮细胞迁移，增强基底上皮细胞的粘附，促进上皮细胞分化，防止上皮细胞凋亡。羊膜细胞释放与创伤愈合有关的细胞因子，包括血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子，血管生成因子，转化生长因子β2（TGF-ββ2）、基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1和TIMP-2）。AM还具有抗炎、抗纤维化、抗血管生成和抗菌特性。它诱导下调TGF-β信号负责伤口愈合过程中成纤维细胞的活化。AM对创面的应用也显著缓解疼痛的烧伤，由于粘附创面及皮肤神经末梢覆盖。许多研究表明，来自AM的细胞能够分化成各种成熟的细胞，包括脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、血管内皮细胞。这些观察表明，AM含有干细胞样细胞可以为再生医学提供一种可供选择的细胞来源。AM在重建手术中已经使用了将近一个世纪。它用于烧伤、溃疡的皮肤，如伤口生物敷料，如眼科手术移植. 到目前为止，人类移植用组织保存在甘油溶液或冻存. *近的研究表明，羊膜上皮细胞在保存后不能存活，目前尚不清楚生长因子是否能通过冷冻保存。本研究的目的是描述一种简单、新颖、廉价、有效的外科手术方法，用新鲜的同种异体移植物修复犬的胃粘膜缺损。

　　方法：所有的手术都是在全身麻醉下进行的，所有的努力都是为了减少动物的痛苦和减少使用动物数量。六条成年雄种犬，年龄约3–5岁，体重20–25 公斤。动物分为两组（每组三只）。在AM组中，犬接受胃粘膜缺损的外科手术，然后用新鲜的同种异体移植物治疗。在阳性（C + VE）对照组、犬进行相同的操作，使用传统的药物治疗。

　　羊膜的制备：通过剖宫产取新鲜胎盘标本，保留完整的胎膜。然后用无菌盐水溶液冲洗来去除剥离后的碎片。胎盘是用含100 U/ml青霉素和0.2 mg/ml链霉素和0.025 毫克/毫升两性霉素B的无菌生理盐水彻底冲洗。然后羊膜用正常的生理盐水冲洗几次，AM被放置在一个含有相同的生理盐水混合液的培养皿中，然后保存在冰箱4 °C存放一周内使用。

　　胃粘膜缺损的诱导及羊膜移植：每条犬都服用硫酸阿托品和甲苯噻嗪，然后用盐酸氯胺酮诱导麻醉和维持麻醉。选定的犬在腹中线进行腹腔镜手术在胃粘膜表面贴个3 cm × 2 cm圆形贴片。在AM组，诱导的溃疡通过由4厘米 ×5厘米的新鲜双层  AM修复。*层缝合胃粘膜伤口采用薇乔3 / 0与上皮侧单纯连续缝合，然后以同样的方式缝合第二层。在C + VE组，一个圆形的补丁没有任何覆盖。开腹手术伤口缝合2层。动物用传统药物治疗。动物接受质子泵抑制剂药物和粘膜涂布机。

　　术后的护理：避免胃酸和胃蛋白酶分泌的刺激，术后前3天禁食。然后用煮熟的米饭和鸡肉喂养动物。AM组和C + VE组均给予甲硝唑和flumox 滴液，连续7天，避免幽门杆菌感染。术后10天拆线 。

　　临床评价：本研究对动物进行日常健康检查，如体温、心脏和呼吸频率、粘膜颜色、淋巴结大小、进食欲望、排尿和排便情况和性格。

　　内镜评价：两组动物的所有犬在术后10天和21天均使用麻醉剂麻醉。使用带视频的内窥镜进行检查。

　　样品：血液样品：从颈静脉收集血液；一部分被存储在含EDTA管中，与另一部分凝集后3500 转离心15 分钟。

　　胃液：经导管采集样品用于内镜评价。，手术后10和21 天收集两组样品并存储在–80 °C用于分析生化和胃蛋白酶浓度。

　　手术活检：术后21天，通过胃造口术对两组动物来收集样品进行组织病理学和免疫组织化学评价。

　　血液学分析：白细胞像：鉴别白细胞计数用传统方法分析如下：一滴血分散在载玻片，血膜甲醇固定2 min，用1:9稀释的Giemsa染色8–10分钟，然后被冲洗和干燥。，在油镜下，通过在包括中心和外围的区域移动镜头，选择了清晰可见细胞形态的区域。共有200个细胞计数，每个白色细胞被记录下来。

　　生化分析：根据doumas所描述的方法估计总蛋白和白蛋白水平。据Lanter计算血清球蛋白。使用试剂盒测定甘油三脂浓度。

　　胃液胃蛋白酶活性的评价：以酪蛋白为底物，用霍克等人描述的方法测定胃液胃蛋白酶活性从不同浓度的牛胃蛋白酶中提取1毫升，从0.1到1 毫克/ 100毫升0.1 N HCl  ，被转移到一个试管和在37 °C 3.9 毫升水浴中培养30 min。10 毫升TCA加入管保持直立10 min后过滤。空白对照是添加酶之前，对每个浓度添加10ml的TCA。滤液的光密度在280 nm波长处测量。对胃分泌的蛋白水解酶活性测定，同样的程序在浓度为2%的0.1 N HCl 。

　　组织病理学评价：实验结束时，从两组胃粘膜缺损处和嫁接处采集样品，并固定在福尔马林中48h。然后用石蜡包埋技术处理这些活组织切片。用切片机切片5 μm厚后HE染色显微镜检查。对两组再上皮化和白细胞浸润引起的溃疡进行评价。0～3淋巴细胞半定量分析炎症反应。溃疡区的炎症是由淋巴细胞计数在三个领域得分（200×放大）（半定量评分：0，< 5%细胞 25=""> 50%）。对石蜡包埋组织块切片进行马松三色染色检测纤维化。

　　结果：临床发现: 研究动物没有表现出健康指标如体温，心率和呼吸，粘膜颜色、淋巴结大小，喂养食欲，和排尿、排便次数和性格紊乱.

　　内镜和外科探查结果: 在C + VE组术后第十天胃内镜检查发现血凝块覆盖在黏膜缺损处。AM组，羊膜覆盖粘膜缺损，无炎症反应，黏膜周围无出血（黏膜部分）。C + VE组在术后第21天使用胃内镜检查显示小圆形溃疡和轻度出血，周围粘膜炎症区。AM组没有发现相同的黏膜缺损，黏膜表面没有检测到的AM。也没有任何炎症或出血的迹象。

　　血液学发现：完整的血象显示术后10和21 天对照组不同程度的红细胞轻度降低。HGB在对照组严重下降表明贫血，但在AM组均在正常的范围。两组的白细胞没有差异。

　　生化检查结果：在术后第十天，C + VE组相比术前和AM组，血清总蛋白浓度（克%）以及球蛋白浓度（克%）明显增加。血清TAG浓度和血清胆固醇浓度在术后第10天显著升高，随后逐渐降低。在第21天时同AM组的血清浓度相同。

　　胃蛋白酶的活性：C+VE组胃蛋白酶的活性在术后10天显著增加，AM组在10和21天显著降低。

　　组织病理和免疫组化结果：AM组的组织病理学检查揭示了正常的组织结构。用MTC染色，疏松结缔组织染色呈蓝色和成纤维细胞染成红色。胶原细胞不被染色。在C + VE组，胃粘膜上皮细胞没有再生留下出血性溃疡。此外，在周围结缔组织中观察到单核炎症细胞。AM组的胃溃疡显示几乎完全的胃上皮再生，除了未被上皮覆盖的微小区域。

　　结论：从本研究中可以得出结论，使用新鲜的是同种异体物修复犬胃粘膜缺损表现出极大的影响为实现对胃粘膜结构的优化改造和上皮前、上皮和上皮后正常胃粘膜屏障的修复提供新方法。