动物实验 中国实验动物信息网 2020-09-03 611

　　中国科学院李劲松研究组生物化学与细胞研究所和第二军医大学长征医院运文研究组将CRISPR-Cas9基因编辑技术与半克隆技术相结合，实现了点突变小鼠的高效生产。

      建立点突变小鼠模型，特别是那些在致病基因中具有点突变的小鼠模型，对于研究基因功能和疾病的致病机制至关重要，但是必须进行同源重组通过编辑胚胎干细胞的传统方法需要大量劳动。*近，可以通过将CRISPR-Cas9直接注射到受精卵中来获得点突变小鼠，但是点突变小鼠生产的效率不高，并且观察到独特型镶嵌现象。李劲松研究小组先前的工作是建立小鼠孤儿雄激素单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs），并获得了半克隆技术，将其注射到卵中以获得健康的小鼠。通过进一步优化技术，我们实现了稳定高效的半克隆小鼠生产。单倍体干细胞（也称为“人工精子”）提供了一种新方法，可以快速制备具有靶点突变的小鼠模型。研究人员首先使用具有点突变的单链寡聚脱氧核苷酸（ssODN，长度为99个碱基）作为修复模板，然后使用CRISPR-Cas9将其转移至单倍体细胞，然后将其靶向。随着突变位点和Cas9酶切割位点（即DNA双链断裂位点）之间的距离增加，获得具有突变位点的细胞的同源重组效率大大降低。如果距离为10 bp或更大，则使用ssODN作为模板效率不高，无法检测到，并且无法获得具有这些位点的突变细胞。为此，项目团队发现创建了一个包含点突变的双链载体作为模板（长度为258 bp-2.1 kb），可以显着提高同源重组的效率。同时，当载体长度为1-1.5 kb时，我们发现了同源重组。*有效。之后，研究人员建立了具有点突变的单倍体细胞系，并通过注射卵有效地获得了具有目标点突变的小鼠模型。在模拟病原点突变的过程中，如果突变位点与DNA双链断裂位点之间的距离小于10 bp，则研究人员可以使用ssODN作为模板。对于≥10 bp的单链断裂，将载体用作模板可提高效率。