动物实验 中国实验动物信息网 2020-09-03 670

　　背景：延迟愈合，骨不连，畸形愈合和骨丢失的治疗是整形外科医师的主要挑战。由于第二项手术是稳定骨折并刺激骨骼生长，因此骨折愈合受损会对患者的生活质量产生负面影响，并增加医疗费用。通常，需要诸如骨移植的辅助手段来刺激骨愈合并填补骨缺损。尽管修复骨缺损的金标准是自体移植，但其使用受到发病率和供体部位供应有限的影响。同种异体移植的局限性包括宿主对移植的免疫原性反应和疾病传播的可能性。为了克服这些限制，正在开发越来越多的生物材料来帮助治疗骨缺损。替代的骨替代物是自体或同种异体的松质或皮质骨，去矿质的骨基质，磷酸钙骨移植替代物或自体骨髓。除了骨移植物和骨替代物外，整形外科医生现在还使用类固醇药物（例如特立帕肽和雷公酸锶）来促进骨折愈合并改善骨骼质量。由于骨骼重塑与骨骼平衡相结合，合成代谢药物会增加骨骼质量，从而增加骨骼强度。雷奈酸锶促进骨缺损的填充并改善大鼠的骨愈合。锶的核心与钙的大小差不多，很容易被人体吸收，并被骨骼和牙齿的珐琅质吸收。雷奈酸锶通过骨骼形成和吸收的双重作用方式改善骨骼的微观结构。该药被批准用于预防绝经后骨质疏松症和髋部骨折。临床前研究表明，雷奈酸锶可增强骨折愈合和骨整合能力，并改善骨微结构。人类和四肢的尺骨具有相似的功能。尺骨骨折通常发生在the骨和尺骨关节处，或尺骨与手腕骨关节处。尺骨骨折会引起严重的疼痛，当骨折愈合时，很难移动受影响的关节，甚至会使手臂变形。自然骨折愈合的*大持续时间约为6周，与对照组相比，锶锶治疗有望更快地愈合。

　　方法：使用新西兰白兔（n = 5）28-32周。手术时的体重为2至2.5公斤。动物可以自由进食和饮水，繁殖室的温度为26-28℃，湿度为60％。所有手术均在动物室的手术室进行。所有兔耳都有永久性标记。手术前称重动物。计算包含镇静剂和肌肉松弛剂赛拉嗪（3 mg/kg）的麻醉剂量（氯胺酮20 mg/kg IM）。肌肉注射抗生素（kombitrim240，1ml/10kg）。刮除兔子的左前腿。在整个实验过程中，所有兔子平均增重0.1–0.3 kg。

　　外科手术：麻醉完毕后，刮除左前腿并将兔子的背部放在手术台上。用碘伏消毒后，铺开一次性无菌纸。在手术过程中进行无菌操作。识别出骨干的尺骨中心，标记皮肤表面，并通过计划的切口进行局部麻醉。进行1.5厘米的纵向切口。确定肌内隔膜并暴露尺骨的中轴。分离软组织以暴露骨骼，并在左尺骨内表面的皮肤边界切一个4 cm的纵向切口，在现有骨干的中心标记2 cm，在末端2 cm。然后将筋膜切开，并用钝器解剖尺骨肌肉并暴露尺骨。截骨的计划位置标记在骨头上，并用小的不锈钢直尺测量。然后使用振动锯进行截骨术，并注意避免损坏骨膜。截骨时用生理盐水冲洗。每个尺骨有一个5毫米的缺损。所有的兔子都接受了手术，并在几天内恢复了正常活动。无伤口感染。手术后一天，所有动物都能自由漫游。没有神经病，如麻痹，抽筋，呼吸困难或疼痛。锶治疗：治疗组中的每只兔子连续6周接受5 ml雷奈酸锶溶液（2 g雷奈酸锶在10 ml蒸馏水中）。

　　宏观评估：尸检后，去除软组织以获得radius骨和尺骨。肉眼观察骨骼缺陷并拍照。 X射线和CT扫描：X射线和CT扫描用于评估每组兔子的骨缺损愈合情况。在第1、3和6周对每只兔子进行扫描，以查看每组中缺陷修复的进展。在全身麻醉下，将兔子精确定位在CT扫描仪的右侧，然后抬起样品架的左前腿。半径和尺骨的长轴垂直于X射线轴对齐。图像层为0.6mm厚，分辨率为2048 x 2048像素。扫描的图像将以DICOM格式保存。高级整形外科医生评估钙化，骨call和松质骨的连续性。

　　骨生长质量评估：评估初始和桥接愈伤组织的形成。 3D重建图像的采集适用于观察和评估骨骼再生。在兔尺骨模型中，如果在骨切片中观察到桥愈伤组织，则可以认为融合成功。桥接愈伤组织必须出现在三个皮质中。由于the骨完整且兔子可以快速支撑体重，因此无法进行骨折愈合的临床评估。通过X光片评估和分析每组的骨生长模式和行为。生化研究：分别在第1、3和6周从耳静脉获得血清骨钙素，碱性磷酸酶，钙和磷酸盐。以10000xg离心10分钟。然后使用相应的试剂盒分析骨钙素，ALP，钙和磷酸盐水平。用酶标仪测量每个参数的光密度。

　　组织病理学：尸检后，将radius骨和尺骨切除。标本用于组织病理切片。将样品在10％中性福尔马林溶液中保存4天，并用10％甲酸脱钙5天。将样品包埋在石蜡中，纵向切割并用HE染色。将切片放大并用光学显微镜检查。病理学家检查了组织病理切片。根据层状骨，编织骨，软骨，纤维组织，软骨内骨形成和膜内骨化的相对比率，每个标本中骨折愈合的进展是定量的。使用X射线和CT扫描收集骨生长数据。结果：在研究结束时，对锶处理过的兔子进行了半径和尺骨X射线检查。在为期6周的研究结束时，所有样品均未显示出放射性治愈。在the骨和尺骨中观察到过多的愈伤组织形成，但在骨折腔中未观察到过量的愈伤组织形成。以上发现表明锶治疗不能明显改善兔尺骨骨折的愈合。在试验组和对照组中，采用Cheung法进行X线骨愈合和骨结合不足测试。尺骨骨折的愈合与锶无关。对照组治愈率较高。在手术后1周内检查所有兔子并进行CT扫描。没有观察到愈伤组织形成的迹象，并且清晰可见0.5cm的间隙。在约3周内观察到*小的愈伤组织形成。从截骨末端开始形成愈伤组织。尺骨和the骨之间出现更多的骨骼，但没有出现在骨骼空间中。在第6周，只有2个样品显示出放射线愈合。实验结束时，图中显示了A组（锶）和B组（无锶）兔子前肢的CT扫描。术后*周内两组进行了CT扫描。没有发现愈伤组织形成的证据。术后三周，在缺损中心和骨边缘发现片状钙化。层状钙化移向骨缺损的中心。愈伤组织在缺损处逐渐扩大。手术后约4周，近端愈伤组织生长更快并到达中央愈伤组织。此后，它生长缓慢并且在大约6周内看到了远端骨call。此时，没有缝隙。骨骼生长用于填充整个截骨部位。骨折在6周内愈合。新骨头的直径小于实际缺损。 Fisher精确检验的P值为0.52、对照组中，X线治愈率为100％，CT扫描治愈率为80％。在手术后1、3和6周测量血清碱性磷酸酶，血钙，血清磷和血清骨钙素的生化参数。比较愈伤组织年龄的血清标志物。在1、3和6周时血清钙和磷酸盐没有变化。但是，第6周的血清ALP和骨钙素水平存在统计学差异。组织学检查显示层状骨，编织骨，软骨和纤维组织的等级和百分比。在不连续的骨标本中，层状骨的存在可能是由半径引起的。但是，锶治疗组和未治疗组之间的愈合没有显着差异。

　　结论：雷尼酸锶治疗兔模型尚未显示促进骨愈合，但实际上骨形成可被延迟，特别是在骨折愈合早期伴有骨腔的情况下有可能。需要进一步的研究以确定雷奈酸锶在较大动物模型中的作用。