动物实验,卵巢早衰 中国实验动物信息网 2020-09-03 549

　　背景：原发性性腺功能减退症定义为卵巢功能异常，卵泡刺激素（FSH）水平高。在女性中，原发性性腺功能低下的*常见形式之一是卵巢早衰（POF），也被称为更年期提前。这是由于卵泡发育速率增加，卵巢发育或闭经期间卵泡数量减少，促性腺激素增加以及月经周期不规律所揭示的卵泡对激素刺激的反应缓慢所致。有可能。先前的研究认为POF是一种具有不同病原背景的疾病。 POF的已知原因包括遗传异常，自身免疫性疾病，环境侵害以及手术，放射疗法和药物治疗后的医源性损害。卵巢早衰的治疗主要包括激素替代治疗和不育治疗。 HRT补充POF患者的雌激素缺乏症，并减轻更年期症状。然而，由于乳腺癌，心脏病发作和中风的风险增加，人们越来越关注这种疗法。因此，HRT通常是早期卵巢衰竭的*后手段，应使用*短剂量和*低剂量。近年来，草药因其有效性，安全性和低成本而引起人们对女性生殖功能障碍的关注。 BRT和HRT的结合对POF患者具有显着的治疗作用，可显着改善月经状态和血清性激素水平。 BTR由四个部分组成：地黄，地黄、,草和山茱wood。体外和体内研究表明，从这些成分中分离出的主要生物活性化合物对卵巢疾病具有抗破坏或药理作用。更重要的是，促血管生成和抗凋亡信号与这些化合物的生物学活性有关。因此，推测BTR对POF的作用可能是通过促血管生成和抗凋亡机制介导的。为了验证这一假设，本研究调查了BTR对雷公藤多甙（TG）诱发的早期卵巢衰竭大鼠模型的影响。方法：诱导动物和卵巢早衰：将严格按照机构指南对所有动物进行护理和治疗。将成年雌性SD大鼠（体重180-220g，12周大）在光/暗循环环境中在室温25±1℃和湿度50±5％下饲养12小时。所有动物都可以自由饮食。实验前一周适应动物设施。测试了50只具有正常发情周期的动物，并且每天分析阴道涂片10天。选择的动物随机分为5组，每组10只：对照组，早期卵巢衰竭模型组，BTR低剂量组，BTR中剂量组，BTR高剂量组。对照组：连续15天每天两次（上午9:00和下午3:00）施用4 ml的0.9％盐水。卵巢早衰模型组：上午9点TG50 mg/kg，下午3点TG50 mg/kg，4 mL 0.9％生理盐水，管饲15天。 BTR低剂量组：上午9点TG50 mg/kg，下午3点TG50 mg/kg + 1.88 g/kg BRT，连续15天口服管饲。 BTR中剂量组：上午9:00 TG50 mg/kg，下午3:00 TG50 mg/kg + BRT 3.75 g/kg，连续15天口服管饲。 BTR高剂量组：上午9点TG50 mg/kg，下午3:00 TG50 mg/kg + BRT 7.50 g/kg，连续15天口服管饲。发情周期评估和样品收集：在给药期间，根据上述方法通过阴道涂片分析每只动物的发情周期。周期长度确定为发情的细胞学观察之间两个不连续的天之间的天数。 ≥15天的发情周期定义为周期停止。如果发情周期数为2个或更多，请计算每只动物的发情周期的平均长度。给药后十五天，在发情前期（末次给药后1-5天）处死发情动物（通过阴道涂片分析）。末次给药后第二天处死停止雌性周期的动物。运行前采集动物股动脉血样。执行后，收集两个卵巢并在电子天平上称重。根据以下公式计算每只动物的卵巢指数：卵巢指数=双侧卵巢湿重（mg）/体重（g）x 100％。血清E2、FSH，P，T水平的测量：使用市售的放射免疫测定试剂盒来测量每只动物的血清E2、卵泡刺激素（FSH），P和T的水平。重复每个测试并计算平均值。 组织学分析：组织化学分析，每只动物的左卵巢用4％中性甲醛固定，包埋在石蜡中并切成3-5μm的厚度。用苏木精-曙红染色。以100倍放大倍率观察横截面并拍照。为了定量评估细胞凋亡，在400x显微镜下随机拍摄每只大鼠的五个切片。随后，随机选择10个非重叠高功率场（HPFS），以计算颗粒细胞凋亡的数量。由两位不了解治疗组的独立分析人员进行计数，并记录平均值。免疫组织化学分析：进行免疫组织化学分析以检测不同治疗组卵巢切片中的VEGF，VEGFR2、Bcl-2、Bax和Caspase 3的表达。用4％中性缓冲甲醛溶液固定每只动物的右卵巢2小时。将固定的样品在梯度乙醇溶液中脱水，包埋在石蜡中，切成3-5μm。使用市售的免疫组织化学试剂进行免疫组织化学染色。*后，将切片在DAB显影，用HE染色，并以100x拍照。评分标准：0，无染色，1、弱染色，2、中度染色，3、强染色。

　　结果：TG诱发的卵巢早衰大鼠模型BTR恢复异常的卵巢周期并改善卵巢指数：在实验过程中，POF模型组中的一只动物死于未知原因弃我们研究了不同动物群的发情周期和卵巢指数。 TG诱导后五天，POF模型组与对照组相比，食物摄入，自发活动和刺激反应减少。在三个BTR治疗组中，动物食物的摄入量没有变化，也没有观察到异常行为。在TG诱导的15天内，POF模型组中的大多数动物显示发情周期被阻滞，其余发情周期比对照组动物更长。然而，这种异常的TG诱导的发情周期明显被BTR以剂量依赖性方式抵消。高剂量的BTR显示出与对照动物相似的发情周期。治疗后，对每组卵巢进行解剖学检查并计算每组的卵巢指数。 POF模型组的卵巢指数显着低于对照组。 TG诱导的卵巢指数降低通过剂量依赖性方式被不同浓度的BTR所抵消。这些结果表明，BTR可以恢复异常的发情周期并改善TG诱发的卵巢早衰。在TG诱发的早期卵巢衰竭模型中，BTR对血清E2、FSH和P水平的影响：在早期卵巢衰竭中，在适当的促性腺激素刺激下，卵巢无法正常运作并产生正常的性激素。先前的研究报道POF与血清E2水平降低和血清P，FSH和T水平升高有关。测量每组的血清E2、FSH，P和T水平。研究BTR对这些生殖激素分泌的影响。与对照组相比，POF模型组动物的血清E2水平显着降低，FSH，P和T水平显着升高。这些TG诱导的变化被BTR剂量依赖性地显着阻止，表明BTR可以改善POF相关生殖激素的异常分泌。 BTR对TG诱发的早期卵巢衰竭模型中初级卵泡，发育中的卵泡和黄体功能的影响：POF显示发育中的卵泡数目减少，影响生殖活动。对卵巢切片进行组织学分析，以研究BTR对TG诱发的早期卵巢功能衰竭模型中初级卵泡，发育卵泡和黄体功能的影响。对照组的染色切片显示皮质和髓质正常，在不同阶段有多个成熟的卵泡。黄体可见，但没有卵泡性卵巢囊肿或黄体血肿。在皮质或髓质中未发现炎性细胞浸润或卵巢纤维化。在POF模型组中，皮质和髓质的组织学异常，原始卵泡和初级卵泡的数量显着减少，卵母细胞成熟和成熟减少。在这些切片中还观察到卵巢间质纤维化，黄体变性坏死，炎性细胞浸润和血管舒张。在三个BTR治疗组中，切片显示可显着降低BTR导致的TG引起的病理变化。 BTR中高组的组织学与正常组和对照组的组织学接近。 BTR对TG诱发的早期卵巢衰竭大鼠卵巢中VEGF和VEGFR2表达的影响：卵巢切片的组织学分析显示每组血管的形态都有变化。进行了免疫组织化学染色，以观察在TG诱发的早期卵巢衰竭模型中两个主要促血管生成因子VEGF和VEGFR2的卵巢BTR表达。与对照组相比，POF模型组的样品的免疫组织化学染色强度显着降低，并且BTR以剂量依赖性方式显着恢复了染色降低。半定量免疫组织化学评估的结果也支持这些发现。 TG诱导的POF降低卵巢VEGF和VEGFR2表达。

　　BTR保护TG诱导的早期卵巢衰竭大鼠模型并减少颗粒细胞凋亡：研究BTR对TG诱导的早期卵巢衰竭大鼠模型颗粒细胞凋亡的保护作用。对照卵巢的染色切片显示，大多数颗粒细胞是健康的，没有凋亡迹象。在POF模型组中，细胞不规则密集，细胞核小而紧凑。另外，细胞核在凋亡后期被破碎，导致空泡化和凋亡小体。 BTR治疗组显示大多数颗粒细胞具有完整的细胞膜和独特的细胞核，定量分析显示所有BTR治疗组（尤其是高剂量BTR组）的凋亡细胞比例均降低。它是。结果表明，BTR可以保护TG诱导的早期卵巢衰竭模型大鼠卵巢颗粒细胞免于凋亡。为了进一步验证组织学检查的结果，我们检查了BTR中几种凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达。与对照组相比，早期卵巢衰竭模型组的bcl-2明显减少，而bax和caspase3明显增加。但是，BTR以剂量依赖的方式逆转了这些变化。

　　结论：目前的研究表明BTR可有效治疗TG诱发的大鼠卵巢早衰。组织学和免疫组织化学结果分析表明，促进血管生成和抗凋亡是受BTR影响的两个机制。