动物实验,糖尿病,PTA 中国实验动物信息网 2020-09-03 643

　　背景：经皮腔内血管成形术（PTA）由于其较高的初始成功率而广泛用于糖尿病性周围血管疾病（PVD）。但是，一年内多达70％的患者发生再狭窄，这限制了该临床应用。尝试通过抗血小板药物，糖皮质激素和钙通道阻滞剂预防或减少再狭窄均会导致药物不良反应。缺乏真正的再狭窄模型限制了研究潜在疗法的可能性。血管成形术狭窄动物模型的安装已用于研究药理和机械方法。在大多数研究中，滥用常规动脉血管成形术球囊来复制PTA人的血管反应（单一损伤模型）是建立动脉粥样硬化模型而不是再狭窄模型。因此，建立可靠的动物模型以研究预防PVD患者PTA再狭窄的潜在治疗方法非常重要。他汀类药物是一种具有抗炎和抗增殖作用的羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）-（CoA）还原酶抑制剂。先前的研究表明，他汀类药物可以减少气球损伤动物模型中的炎症和内膜增生。由于这些原因，它在临床上被用作PTA患者的常规治疗方法，以控制再狭窄的发展。但是，在我们的日常工作中，我们发现他汀类药物抑制再狭窄的临床作用是次要的。在该实验中，建立了新西兰白兔的双损伤再狭窄模型，以模拟PTA高血糖后再狭窄的增殖过程。阿托伐他汀是使用*广泛的他汀类药物。因此，在这项研究中，使用阿托伐他汀来测试他汀类药物对再狭窄的抑制作用。该动物模型用于研究糖尿病患者PVD治疗后再狭窄的潜在治疗方法或了解再狭窄本身的机制。

　　方法：动物：新西兰雄性白兔（1-7.7公斤）。将兔子单独地饲养在标准兔子笼中，并以12:12的光：暗周期存储。在实验开始前一周，给予致动脉粥样化饮食（胆固醇1％），喂食后将动物处死。在研究过程中，所有兔子都可以自由进食。测试方案：诱导实验性糖尿病：禁食过夜后，通过兔的耳静脉注射新鲜制备的80mg/kg的四氧嘧啶溶液。注射四氧嘧啶后，动物可以自由获取食物和水。确认低血糖后，口服20％葡萄糖溶液以防止低血糖休克。在四氧嘧啶注射后一周测量血糖水平，并且将血糖水平高于300mg/dl的动物视为糖尿病并用于测试。 双重损伤手术：（1）球囊诱发的内皮损伤手术引起动脉粥样硬化斑块的形成。诱导糖尿病后*个星期，用苯巴比妥麻醉兔子。使用标准的外科手术程序正确解剖大隐动脉，并如上所述插入一根2.5mm的线引导球囊导管以损伤the动脉。超声证实在*次手术后约4周，严重的动脉粥样硬化对damage动脉的损害。 （2）接下来，PTA引起再狭窄斑块。解剖右股动脉远端后，将球囊导管插入受损的内动脉，并在初始受损部位进行PTA。经过以上处理，彩色多普勒显示showed动脉硬化。由成功的双重伤害手术引起的再狭窄模型随机分为4组：7天再狭窄组（1组，n = 6）14天再狭窄组（2组， = 6）； 28天再狭窄组（3组，n = 6）和28天阿托伐他汀治疗组（A组，n = 6）。阿托伐他汀的剂量（2.5 mg/kg/d）。在双重损伤手术当天开始阿托伐他汀口服管饲。除未插入气球外，六只假手术的糖尿病兔子接受了相同的手术。获得组织学和形态学分析：在每个时间点（双重损伤手术后7、14、28天）处死动物（第28天的A和C动物）。收集耳朵血液样本以检测血清总胆固醇，甘油三酸酯，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白胆固醇水平。获得受损的动脉节段，用4％甲醛固定，包埋在石蜡中，切成5微米的切片。 HE染色观察大体形态，胶原和平滑肌细胞（SMC）进行Masson三色染色。图像分析软件用于内膜生长的形态分析。内膜生长是通过内膜面积与内部弹性层的比率（内腔横截面面积变窄）和内膜面积与内部比率的估计。

　　免疫组织化学分析：石蜡组织切片，脱石蜡，梯度乙醇水化。使用微波中的EDTA缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，0.05％Tween20，pH 9.0）进行20分钟的热诱导抗原回收。冷却后，将切片与3％过氧化氢一起孵育。用含5％山羊血清的PBS封闭后，将切片与一抗在4°C孵育过夜。用PBS洗涤后，将切片与二抗在37℃下孵育30分钟。通过过氧化物酶底物溶液，含有0.02％（w/v）H2O2和0.1％（w/v）3,3-二氨基联苯胺盐酸盐的PBS可以看到阳性反应。苏木复染色。对于阴性对照，请使用小鼠IgG抗体代替一抗。使用抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（1：400稀释）测量细胞增殖。计数PCNA阳性细胞。根据以下公式计算PCNA指数：PCNA阳性细胞/总细胞x 100％。

　　免疫荧光染色：免疫荧光染色。简而言之，3％的过氧化氢温育会抑制内源性过氧化物酶活性，并用5％（v/v）的山羊血清封闭1小时。用PBS洗涤后，将切片与FITC标记的平滑肌肌动蛋白抗体（αSMA）（1：100）孵育4小时。第二次洗涤后，用dapi-fluormount-g准备切片。用荧光显微镜检查标本。 结果：动物：在实验开始时总共使用了45只新西兰白兔。注射四氧嘧啶后，由于血糖不足，血糖增加了30，而5和10中的致命死亡被排除在外。在30只糖尿病兔子中，有24只接受了双重损伤手术，并且全部实现了再狭窄。测量糖尿病兔子的体重和血糖水平。在整个研究中，血糖水平维持在300 mg/dl以上。第28天，C组血清总胆固醇为18.75±0.44 mmol/L，3组为18.47±0.54 mmol/L，A组为9.44±0.27 mmol/L。 c和3组之间的血清总胆固醇无显着差异，而a和3组之间的差异具有统计学意义。血清低密度脂蛋白胆固醇水平也相似（C组为10.2±0.35 mmol/L，3组为10±0.34 mmol/L，A组为4.60±0.18 mmol/L）。血清甘油三酯水平（C组2.01±0.04 mmol/L，3组2.15±0.05 mmol/L，A组1.36±0.05 mmol/L）。两组之间的血清HDL胆固醇水平无显着差异。 双重损伤模型的组织病理学研究和时程：原发性损伤后的内膜增厚涉及PTA后基质细胞中嵌入的SMC作为基质。双重伤害后，有明显的创伤迹象，包括内部弹性层广泛断裂以及内膜解剖进入基质。在再狭窄时程方案中，使用18只兔子观察再狭窄过程。结果显示，与C组的兔动脉相比，双重伤害手术期间的c内膜逐渐增加。第7、14和28天的狭窄率分别为21±5.85％，60.93±12.46％和90.02±3.11％。同样，第7、14和28天的膜/介质比分别为0.35±0.05、1.63±0.29和1.86±0.14、 PCNA的*大表达出现在7天，然后逐渐下降。 α-肌动蛋白的免疫组织化学（标记为平滑肌细胞）显示，在每个时间点，内膜几乎完全被平滑肌细胞包围。 在双重损伤模型中阿托伐他汀对狭窄率和内膜/内侧区域的影响：阿托伐他汀治疗28天并没有降低家兔双侧ilia动脉损伤的狭窄率。它匹配狭窄率。在三个内侧组中，内膜/中膜的比率显着增加，而阿托伐他汀治疗并没有减少A组内膜/中膜的比率的增加。阿托伐他汀对细胞增殖和SMC迁移的影响：进行了PCNA和Masson三色染色以及αSMA免疫荧光法进行细胞增殖，以进一步阐明阿托伐他汀在双重损伤模型中对再狭窄的作用。做到了评估新内膜平滑肌细胞的迁移。三组动脉损伤后PCNA指数显着升高。阿托伐他汀治疗后PCNA指数没有变化，与a组相比也没有变化。 α-肌动蛋白免疫组织化学结果显示，阿托伐他汀治疗组（A组）和非他汀治疗组（3组）的内膜中有大量平滑肌细胞，两组之间无显着差异。正在显示。结论：总而言之，有可能反复开发模仿PTA后人类再狭窄的动物外周动脉再狭窄模型。该模型将有助于研究再狭窄的机制和治疗干预计划。发现阿托伐他汀在抑制再狭窄过程中没有治疗作用。需要进一步研究以找到更有效的治疗方法。