动物实验,骨关节炎（OA） 中国实验动物信息网 2020-09-02 588

　　背景：骨关节炎（OA）是*常见的关节疼痛和功能障碍综合征，具有不同程度的功能限制和较差的生活质量。由于大多数骨关节炎是不可逆的和进行性的，因此软骨层丢失了。 OA的*理想治疗方法是阻断软骨分解代谢并促进正常的软骨再生。骨关节炎的姑息治疗通常集中于疼痛和不适，改善运动功能并防止进一步的变性。 OA临床治疗的主要方法包括广泛使用非甾体抗炎药，止痛药和透明质酸。这些症状可在短期内缓解，但无明显改善疾病的作用。因此，迫切需要开发替代剂以从根本上防止软骨的破坏或促进其适当的修复。努力寻找使用细胞来源的有效软骨保存方法。分离的软骨细胞的扩增和移植方法被认为是基本解决方案。软骨细胞培养的主要问题是透明软骨特性的丧失。在狗模型中，据报道培养的自体软骨细胞不能恢复正常的透明软骨。富血小板血浆（PRP）定义为血小板计数大于1 x 106细胞/微升的血浆，其血小板含量是正常血浆的4-8倍。 PRP具有多种生长因子，包括血小板衍生的生长因子和转化生长因子-β。 PRP具有血管生成，抗炎和抗降解的特性。据报道，PRP转化生长因子-β和成纤维细胞生长因子对软骨具有合成代谢作用。这些因子通过刺激血管生成以及调节细胞迁移和增殖来促进伤口愈合和细胞外基质重塑。根据以前的研究，我们推测PRP和脂肪间充质干细胞的组合对软骨再生具有协同作用。这项研究的目的是使用犬OA模型研究PRP和脂肪间充质干细胞对炎症过程中关节软骨形态和再生的影响。

　　方法：PRP准备：使用双重旋转方法准备自己的PRP。收集50毫升新鲜血液，并加入7毫升柠檬酸葡萄糖配方A。然后将血液以1200pm离心10分钟，并分成三层：血浆，白细胞和红细胞。将血浆和血沉棕黄层分离到新的试管中，并将混合物以2500pm离心10分钟。丢弃上清液，仅留下20％的血浆。将对收集的血浆（PRP）进行全血细胞计数测试，并确保其≥1 x 106血小板/μL。制备的PRP在6小时内使用。脂肪间充质干细胞的分离和培养：从狗腹壁的侧面取出约15克脂肪组织。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗多次，以去除残留的麻醉剂和血液。在37度水浴中用0.075％I型胶原酶消化2小时，然后每30分钟翻转一次。加入等体积的DMEM和10％的胎牛血清，然后以1200pm离心10分钟。去除上清液和血脂。用PBS洗涤细胞颗粒，并通过100μm尼龙筛过滤。在相同条件下离心后，将细胞悬浮在含有改良的低糖DMEM培养基和10％胎牛血清培养基的100×20mm细胞培养皿中。 24小时后，用PBS冲洗非粘附细胞和碎片，并每周两次更换细胞培养基。在*和第二段之间收集并使用脂肪来源的间充质干细胞。建立的MSC流式细胞术分析得出脂肪来源的间充质干细胞分化组（CD）34、CD45和CD29，CD44阳性。

　　狗十字韧带截肢模型：在该实验中，选择了24只健康的比格犬。狗重7.7±1.1公斤，年龄2-3岁。在麻醉下，没有。 11用手术刀除去右后腿上的十字韧带。使用常规方法缝合结缔组织和皮肤。术后给予镇痛药（曲马多8 mg/kg，皮下）和抗生素（恩诺沙星5 mg/kg，皮下）3天。在软组织愈合一周后，每只狗每天行走10分钟，持续2个月。之后，每周进行一次治疗，持续一个月。两个月后，这只狗被杀死并收集了一个标本。 MSC和PRP的应用：建立犬骨关节炎模型后，每周给每组材料注射一次，对动物进行关节内注射，持续一个月。对照组用1 ml PBS处理，PRP组为1 ml PRP，MSC组在1 ml PBS中包含1x107。脂肪来源的间充质干细胞，MSC和PRP组（MP）在1 ml PRP中包含1x107 PRP。对照犬的对侧囊在没有任何治疗材料的情况下进行了组织病理学检查。

　　评分：me行评分：surgery行评分是在手术前后每月进行一次测量。所有的狗在手术前都正常行走，并且不能轻抚。使用以前的评分系统，0，没有明显的柔软度，1、轻微的侧向重量转移，但是在走路和走路时柔软。 4.走路时无法承受体重； 5.走路和站立时无法承受体重。三名兽医评估了of行程度。局部抗压强度的测定：在取走了动物的样本后，通过计算机测试了股骨和胫骨关节表面的体外抗压强度（0.2 mm）。测量点是股内侧和胫骨con的中央区域。组织学：股骨外侧con和胫骨taken中央区域的关节软骨取自每组的膝关节。将它们用10％中性福尔马林缓冲液（NBF）固定，并用脱钙溶液（24.4％甲酸和0.5N氢氧化钠）脱钙14天（混合脱钙溶液连续14天，每天1天）。已交换两次）。纵向修剪每个股骨和胫骨的关节软骨。包埋石蜡切片（3-4μm），并用Sirius Scarlet染料对软骨组织进行染色。 ECM组成分析：冻干每组膝关节的股骨和胫骨关节软骨部分以获得干重。然后将片段消化并用于糖胺聚糖和胶原蛋白分析。用紫外可见分光光度计测量甲基亚甲基蓝硫酸化GAG，以确定GAG含量。 Erlich的羟脯氨酸含量可测量胶原蛋白含量。使用下式（μg羟脯氨酸x稀释倍数）/0.13 =μg胶原蛋白将羟脯氨酸含量转换为胶原蛋白含量。人的半月板羟脯氨酸约占胶原蛋白氨基酸含量的13％。  ECM相关软骨细胞基因mRNA表达：实时荧光定量PCR技术检测股骨和胫骨关节软骨j监测SOX9基因和蛋白聚糖信使RNA的表达。 BrdU摄取测量：通过腹膜内注射5-溴脱氧尿苷标记增殖的细胞，以评估MSC和PRP或其组合（MP）对狗膝关节细胞增殖的影响..给狗腹腔注射BrdU 50 mg/kg，溶于盐水至1 ml/kg，72小时后处死动物。使用切片上抗BrdU抗体的免疫组织化学染色检测到BrdU掺入。免疫组织化学：用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物纯化一抗，并观察BrdU作为细胞增殖标志物的免疫反应性。使用经间充质干细胞，PRP或结合物，caspase-3、截短聚（ADP）核糖聚合酶（PARP）和肿瘤坏死因子（TNF）处理后制备的股骨和胫骨表面软骨组织）-我观察到了对α的影响。环氧合酶（COX）2、白介素（IL）-1β干扰素（IFN）-γ，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）免疫应答。

　　骨组织形态计量学：为了观察更详细的组织病理学变化，番红O染色了关节软骨损伤，并使用Mankin评分系统对其进行了评估。分数越高，OA越严重。基于计算机的自动图像分析仪可对制备的纵向切割样品上的股骨和胫骨关节软骨的厚度进行分析。进一步分析了每组六个股，胫骨关节区域的组织学区域。超过20％的免疫反应被认为是阳性的。

　　结果：MP组的me行评分低于其他组，两组之间无显着差异。在治疗后2个月和3个月，PRP和MP组的me行评分明显低于治疗前。对照组的股骨和胫骨关节软骨的局部抗压强度明显低于假手术组。然而，三种材料的处理显着提高了局部抗压强度。 MP组的局部抗压强度高于其他治疗组。与假手术组相比，对照组的Mankin评分显着提高。已经发现，与对照组相比，在治疗股骨和胫骨的关节软骨中所有三种测试材料的Mankin得分均显着降低。特别是，MP治疗组中的狗的Mankin得分*低。 MSC和PRP关节软骨的厚度均高于对照组。与PRP组相比，MP组对关节表面的影响更为明显。与假手术组相比，对照组的细胞因子含量明显降低。但是，与对照组相比，每个治疗组均显着增加。实时荧光定量PCR检测ECM相关基因，聚集蛋白聚糖，Sox9基因表达低于假手术组。但是，这三种测试材料显着改善了这些下调基因的表达，其中MP组显示出*强的基因表达。与假手术组相比，对照组的股骨和胫骨关节软骨中的BrdU阳性细胞明显减少。每个治疗组与对照组之间存在显着差异。 MP组的软骨细胞增殖明显高于MSC或PRP组。与假手术组相比，对照组的Caspase-3和PARP免疫阳性细胞显着增加。但是，对这三种测试材料的处理导致这些细胞数量的显着减少，其中MP组中的细胞百分比*高。对照组股骨软骨和胫骨软骨中的肿瘤坏死因子α，COX-2、IL-1β，iNOS和IFN-γ染色的细胞明显增加，这与假手术组有显着差异。这些促炎细胞因子在治疗组的软骨增加少于对照组。

　　结论：这项研究表明，MSC和PRP的组合通过ECM合成，软骨细胞增殖以及抗炎反应，对OA具有有益的协同作用。因此，MSC和PRP的联合疗法作为治疗OA不可逆的关节变性的炎症调节剂可能非常有用。