动物造模,膝关节多发性缺损,软骨细胞移植 中国实验动物信息网 2022-10-24 528

　　背景：由于关节软骨不能自然愈合，因此无法治愈能够以一致且可预测的方式再生透明软骨的方法。一些公认的软骨修复方法包括微创（MFX）和基质诱导的自体软骨细胞移植（MACI）。 MFX可提供短期临床改善，但由于纤维软骨和纤维修复组织的性质，这种改善在2-5年后趋于恶化。 MACI具有类似的临床改善，但比MFx更耐用。但是，MACI治疗的局限性在于需要进行两次单独的手术程序以及细胞培养的高昂费用。*近，使用软骨芯片已成为一种潜在的治疗方法。已发表的研究集中在少年和自体软骨芯片与脚手架结合或嵌入纤维蛋白胶中，但长期结果尚待研究。开发新的外科疗法并测试现有的疗法需要大型动物模型，这些模型必须具有成本效益，可靠且可预测。小型猪以前曾用于软骨修复研究。骨在18个月时达到成熟，其特征是股骨远端生长板闭合和软骨成熟。直径为5毫米的缺陷已被证明是关键尺寸。骨成熟对于防止因内在愈合而导致的修复反应高估很重要。动物的大小和关节的大小使小型猪成为软骨研究的诱人动物模型。对于动物模型中的愈合反应的组织学评估和可靠的翻译结果，成像必须与人类相当。另外，使用具有多个软骨缺陷的动物在经济上和伦理上都很重要，因为使用多个缺陷可以减少研究人员使用的动物数量。尚未研究关节多处损伤的修复效果。这项研究的目的是验证以下内容：1）验证是否使用现有的临床修复技术将小型猪用作软骨和骨软骨修复的临床前模型； 2）1我们研究两个膝盖缺陷（双缺陷膝盖）与膝盖缺陷的修复效果相比，是否会影响修复效果。

　　方法：实验设计如图所示。测试了两个独立的研究假设。所有动物都进行了双侧膝盖手术。*项研究表明每个膝盖有一个缺陷。使用10头小型猪（5头雄性和5头雌性）。使用五种不同的治疗方法和两种不同的空白对照测试了每个膝关节缺损的适用性和修复反应。在第二项研究中，每个膝盖有2个缺陷，而6只雄性迷你猪每个膝盖有2个缺陷。比较了邻近缺损，单膝缺损和双膝缺损的治疗效果。小型猪的平均年龄为21个月（18.5-23.7个月）。平均重量为41.9千克（32.4-47千克）。麻醉：将阿扎哌隆（0.1ml/Kg）和苏木安（0.1ml/Kg）皮下给药以诱导麻醉和镇静作用。通过耳静脉给予依托咪酯（0.25 ml/Kg）进行全身麻醉，并插入气管导管（规格6.5）。为了维持全身麻醉，请使用七氟醚（3％）和芬太尼（0.175ml/kg/h）。手术前，用预防性抗生素（青霉素0.03 ml/kg）治疗动物。

　　外科手术：局部镇痛药作用于关节周围的皮肤和组织（Zerokine，10ml，20mg/ml）。标记the骨远端杆和胫骨结节，并在into骨韧带上直接做一个5厘米的中线皮肤切口。暴露the骨韧带并获得从from骨远端到胫骨结节的ella骨韧带切口。该切口暴露con间窝和滑轮。在单膝关节损伤的小型猪中，在were间股骨附近的滑车槽内约2 cm处发现软骨或骨软骨缺损。膝关节软骨的双重缺损，一个位于滑车槽内，在con间窝内约2 cm，而其他骨软骨缺损位于滑车槽外，在内侧骨槽内约1 cm。软骨缺损概述使用6毫米皮肤活检打孔器和刮匙，小心地剥去软骨，直到除去所有软骨，包括钙化的软骨层，并且未见软骨下出血。使用空心的6毫米钻头创建直径6毫米，深度8毫米的骨软骨缺损。进行缓慢的手动钻孔以避免对组织的热损伤。表中所示的治疗后，缝合pat骨韧带，皮下组织和皮肤。手术后，连续5天给动物口服氟尼辛葡甲胺1.1 mg/kg镇痛和抗炎作用。如表1所示，将单个缺损膝关节缺损随机分为7组。双膝缺损被随机分为自体骨移植物（ABG）或自体双组织移植物（ADTT）。 磁共振成像（MRI）：要评估修复的组织表面，软骨下骨组织和修复的组织的信号强度，请在术前使用MRI扫描每个小型猪并使用3T全身磁共振扫描仪。手术后3至6个月使用。 ..使用以下顺序：双回声稳态（DESS，3D成像视野（FOV））151 x 180 x 90 mm;采集矩阵216 x 256 x TR128; TR13.5; TE5.0;翻转角28° ;采集时间5分25秒），空间（3D成像的视野98 x 180 x 78 mm，采集矩阵140 x 256 x TR112、TR1000，TE40.0，ETL52、采集时间3分57秒），MPRAGE（3尺寸成像视场为120×183×99.8 mm，采集矩阵为168×256×TR128，TR2200，TE2.65TI900，采集时间为3分49秒）。所有3D成像序列均使用0.7x0.7x0.7 mm的各向同性体素方法。 计算机断层扫描（CT）：在手术后3个月和6个月对每只动物进行CT扫描，以评估骨修复的软骨软骨损伤，组织学修复和软骨下骨囊肿的存在。我坏了选择Micro CT是因为其临床重要性。为了实现0.6 x 0.6 x 0.6 mm的*高各向同性分辨率，在技术上应用了以下扫描参数：120kV，200mAs，层厚度0.6mm，螺距系数0.5mm和307mm视场，0.3毫米过滤器或b40f或b80f增量。要确定骨骼缺陷的数量，请在2D幻灯片上绘制与骨骼缺陷相对应的感兴趣区域（ROI），然后使用OsiriXROI体积工具计算骨骼缺陷的体积。通过将剩余的缺损体积与原始穿孔缺损进行比较，计算出骨缺损修复率。组织学：手术后六个月，处死动物并拍摄完整的缺损图片。样品在4°C下随着乙醇浓度增加（70-96％）脱水。在除去2-异丙醇和二甲苯之前，先在4°C下浸渍甲基丙烯酸甲酯（MMA）。在-20°C下，MMA会加速N'N-二甲基-对甲基苯胺的聚合。使用切片机将缺陷样品切成10μm的连续切片。用苏木精和曙红（HE），甲苯胺蓝，番红花对样品染色。*项研究根据细胞形态，糖胺聚糖（GAG）染色和组织表面修复评估了每个治疗组的样本量。在第二项研究中，两名经验丰富的员工使用ICRSII评分系统盲目评估了维修响应。

　　动物福利：受过训练的动物园饲养员每天将在兽医的监督下仔细观察每只动物3次。当动物饲养员认为小型猪不舒服或不舒服时，无论是单独饲养还是与动物饲养员互动时，其总体外观，食欲，临床症状（体温，粪便，体温，粪便等）根据动物的等级和行为对其进行进一步评估，每个类别得分为1-4、术后第4天观察到轻度mild行，食欲不振和活动能力下降。结果：在止痛治疗的前5天，动物没有肿胀，食欲下降，活动水平没有下降。 pat骨韧带的手术方法提供了与内侧和外侧滑轮表面完全接触的机会。皮带轮的内表面和外表面非常适合6 mm的缺陷。

　　首次研究：在任何治疗组中均未发现透明软骨的完全再生。软骨治疗组有效，但修复组织的表面被淹没，GAG阳性染色很少。*糟糕的结果是发现了一个空缺，主要是纤维组织（图3a），而*好的结果是在MACI组中合并了玻璃体组织和纤维软骨。术后3个月至6个月之间，缺损存在明显差异，MACI组中的不透明组织光滑且轻微浸没。骨软骨治疗组的*差结果还发现有一个主要纤维组织为空的缺损。骨软骨修复效果*好的是ADTT组，主要发现是玻璃体组织和纤维软骨占优势。 MRI显示中空缺损表面明显凹陷，ADTT组的缺损组织充满了健康的软骨。 CT成像显示从3个月到6个月骨量显着增加，表明软骨下骨持续再生。软骨下骨量从3个月增加到6个月，平均36％。与天然软骨下骨的水平相比，六个月后的平均骨丢失仅为0.06 cm（SD±0.04）。

　　第二项研究：ADTT和ABG治疗组之间的膝关节无显着差异。相邻缺陷之间的ICRSII评分无显着差异。

　　结论：基于这项研究的结果，作者提出了小型猪作为软骨修复的合适动物模型。进行了6个月的临床相关治疗，组织学类似于人类的发现。 CT成像对证实软骨下骨修复的监测至关重要，建议对所有骨软骨治疗进行评估。事实证明，具有双膝缺陷的雄性小型猪是*经济的方法。