动物实验,硬脑膜动静脉瘘 中国实验动物信息网 2020-09-02 701

　　背景：硬脑膜动静脉瘘（DAVF）是指动脉与脑膜或硬脑膜窦或皮层静脉之间的异常连接。这是颅内血管畸形,硬脑膜动静脉瘘约占颅内血管畸形的10％至15％，幕上动静脉畸形的6％和下颌静脉动静脉的畸形的35％。尽管硬脑膜动静脉瘘可发生在任何地方，但这些血管畸形*常见于海绵窦，外侧窦，乙状窦和矢状窦（SSS）。 DAVF治疗的主要形式是血管内栓塞。 DAVF的原因未知。有一个独特的后天原因。有观点认为，硬脑膜动静脉瘘是由颅内动静脉畸形和硬脑膜血管异常引起的先天性疾病。在许多临床试验中，硬脑膜动静脉瘘的形成可能是由于脑外伤，窦炎，窦血栓形成，颅内肿瘤，脑外科手术，血凝过多，血液分子异常等引起的。显示。 DAVF是一种获得性血管疾病。据信获得性DAVF是由于DAVF与窦血栓形成之间的密切关系。许多研究人员已经在大鼠窦性高血压模型中建立了颈总颈外吻合术（CCA-EJV）。 1）高窦压可能诱发DAVF； 2）自动排除大窦压后DAVF消失； 3）手术后28天，高血压组静脉压明显增加； 4）鼻窦血栓形成是高鼻窦压力的危险因素。 DAVF形成的重要原因是颅内窦压力升高。有两种理论上的解释。一种是开放的“生理动静脉吻合术”，另一种是“血管内皮生长因子诱导的硬脑膜新血管形成”。这项研究的目的是使用兔子模型压力诱导高颅内静脉形成，以研究更详细的DAVF形成机制。在这项研究中，我们使用了cca-pfv吻合术来生成高颅内静脉压的模型，并成功地形成了DAVF。首次在兔模型中发现了缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子的表达。

　　方法：实验动物：该研究得到了福利伦理委员会的批准。 100只日本大耳兔（体重2.0-2.5kg）。 麻醉：向耳静脉（EV）注射1％戊巴比妥钠（25 mg/kg），以诱导麻醉，例如动静脉吻合，放置颈动脉导管和收集样品。通过脑血管造影导管将1％戊巴比妥钠注射入颈动脉。动物准备：将实验动物分组：将50只日本长耳大白兔随机分为5组，A-E.A组（对照组）假手术（n ＝ 10）。在B组中，进行了右颈总动脉（CCA）-面后静脉（PFV）端对端吻合（EEA）（n = 10）。在C组中，进行了右颈总动脉（CCA）-面部后静脉（PFV）和左颈外静脉（EJV）（n = 10）。在D组中，进行了右颈总动脉-后面部cca-pfv端对侧吻合术（n = 10）。在E组中，进行了右颈总颈后面部cca-pfv和左颈外静脉（EJV）结扎的端侧吻合术（n = 10）。在手术后第7、14和90天从每组中随机选择两只兔子，并在注射墨水后计数硬脑膜微血管的数目。手术90天后，每组选择四只兔子进行数字减影心血管造影，以观察DAVF的形成。此外，将50只日本白兔随机分为5组，即A-E组。 A组（对照组）假手术（n = 10）。 B-E组（n = 40）进行了右颈总动脉（CCA）-面后静脉（PFV）端对端吻合（EEA）和左颈外静脉（EJV）结扎。对于B，C，D，E组（n = 10），在术后1、2、3和90天收集标本进行免疫组织化学（每组6个）和Western印迹。我们。分析（每组4个）。模型准备：动物在手术前禁食10个小时，没有饮用水限制。将1％戊巴比妥钠（25 mg/kg）注入左耳静脉EV。麻醉后，将兔子固定在手术台上。剃光脖子，用碘消毒，并在脖子上做一个皮肤切口。在显微镜下执行以下步骤。

　　1、A组：解剖学将双侧颈外静脉分开。近端是前静脉和后静脉与颈外静脉相交处的前1 cm结扎带，远端是前静脉和后静脉与颈外静脉相交处的1 cm结扎。这是一个连字。暴露右颈动脉三角形，以清楚地分开2 cm CCA。将24＃静脉（IV）导管分别插入面部后静脉（PFV）和CCA，并连接到有创压力计以测量CCA和PFV的实验压力。局部应用少量青霉素并缝合切口。

　　2. B组将双侧颈外静脉和右CCA分开（长度与假手术组相同）。测量正常动脉压和PFV压力。结扎右颈外静脉的前端（在前，后前静脉与颈外静脉的交界处0.5 cm）。结扎远侧前静脉（AFV）。用血管夹钳住PFV，在面后静脉（PFV）与颈外静脉相交之前切出约3 cm。修剪CCA的近端，结扎并切割远端，并用1mg/ml肝素/盐水冲洗血管腔。其余的CCA和PFA用亚甲蓝染色，并用1 mg/ml肝素/盐水洗涤。端到端CCA和PFV吻合用9-0缝合线进行。吻合后，确认吻合口通畅。吻合后测量PFV压力，在切口上涂少量青霉素，然后缝合伤口。

　　3、C组将右CCA，EJV和左EJV分开。左EJV用4-0缝合结扎。其他操作与B组相同。

　　4.在D组中，将双侧颈外静脉和右CCA分开（分离长度与假手术组相同）。测量正常动脉压和PFV压力。结扎右EJV的前部和AFV的远端。夹紧PFV，并在PFV和EJV的交点处切约3 mm。血管腔用1 mg/ml肝素/盐水洗涤。使用两个容器夹来夹紧CCA，两个夹之间的距离约为1.5厘米。用微型剪刀沿着容器的壁切。切口的长度是管道直径的1.5倍。用1mg/ml肝素/盐水洗涤血管内腔。用亚甲蓝将CCA切口和PFV残端染色，并用1 mg/ml /肝素盐水洗涤。在颈总动脉和PFV之间用9-0缝线进行端侧吻合。检查吻合口的光滑度。测量吻合后的PFV压力，并用少量青霉素缝合切口。

　　5、E组：独立的CCA，EJV在右侧，EJV在左侧。左EJV用4-0缝合结扎。其他操作与组D相同。压力测量：解剖5组中的50只兔子的右颈总动脉（CCA），并测量CCA压力。

　　颈总动脉血压测量：剥下CCA约2厘米，从尾巴插入24＃IV导管，用血管夹固定，然后连接至非侵入性血压测量设备。在心脏水平，压力调整为零。读数稳定后，拍照并记录。面静脉压测量：将5组的50只兔子的后静脉（PFV）剥离，并测量PFV压力。右颈外静脉，前静脉和后静脉的总长度约为2厘米。 24＃IV导管通过静脉瓣膜插入PFV，固定并连接到有创压力计。在心脏水平，压力调整为零。读数稳定后，拍照并记录。吻合后测量面部静脉压力：B-E组中的40只兔子在测量PFV压力和吻合之前，确认了cca-pfv吻合后的通畅。 24＃IV导管通过静脉瓣膜插入PFV，固定并连接到有创压力计。在心脏水平，压力调整为零。读数稳定后，拍照并记录。墨水灌注：从B-E组和A组CCA-PFV吻合后的第7、14和90天，每组选择两只兔子进行颈部灌注。计数硬脑膜微血管密度。 DSA测试：手术后90天，在5组中的每组中选择4只兔子进行DSA测试。具体步骤如下：

　　将导管放在颈动脉中。通过耳静脉注射1％戊巴比妥钠（25 mg/kg）麻醉动物，将兔子仰卧，并将其固定在手术台上。沿原始颈部切口进行解剖。仔细解剖右动静脉吻合部位。有许多新的脉络正在形成。确认吻合处无阻塞后，测量术后面部静脉压力。纠正吻合部位。取下左侧的CCA并放置24G IV导管。导管中充满了1 mg/ml肝素，并关闭了颈部切口。采集

　　DSA图像：通过CCA注入1％戊巴比妥钠并将兔子的背部固定在DSA桌子上。调整机器位置，并通过CCA造影剂导管（2ml/s，3ml）注射iohexol-300。拍摄前后的X光片。免疫组化：对照组，第7、14、21、90天组，各6只兔的枕叶和硬脑膜标本中的HIF-1α和VEGF免疫组化我收集了枕叶皮质的选择是因为该区域首先受到吻合术的影响，导致颅内压升高并且可以更方便地进行检查。将组织的免疫组织化学切片固定在福尔马林中，包埋在石蜡中，并用苏木精和曙红（HE）染色。组织切片与以下主要抗体一起孵育：血管内皮生长因子（VEGF）（C）（1：100），缺氧诱导因子-1α（1：200），4°C过夜。接下来，将它们与辣根过氧化物酶标记的小鼠抗兔二抗（1：1000）孵育。 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）方法用于免疫组化分析。所有样品均在倒置显微镜和Olympus BX51摄像系统下进行观察。百分比是阳性细胞数除以细胞总数。用于表示级别分配值的标准是：-= 0％，+ =\→ 0％-25％，++ = 26％-50％，+++ = 51％-75、 ％，++++ =\→ 75％。

　　Western Blotting：从枕叶皮质和硬脑膜中取四只来自对照组，第7、14、21和90天组的兔子进行Western印迹。将样品溶解在RIPA缓冲液中，并且通过Bradford方法测量蛋白质提取物的浓度。将40μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移到10％PVDF膜上，并在含有0.1％Tween 20和5％脱脂奶粉的TBS溶液中孵育。接下来，用特异性血管内皮生长因子VEGF（C-1）一抗（1：200），HIF-1α一抗（1：200）和α-微管蛋白（分子量52 kDa，1：3000）处理膜。在4°C下孵育过夜。将膜与标记有辣根过氧化物酶（1：1000）的小鼠抗兔抗体一起孵育。使用增强的化学发光辣根过氧化物酶底物观察免疫应答区域。结果代表3次独立实验。定量分析由GE Image Scanner的QuantityOne软件执行。

　　结果：B组和C组动物在手术后存活。由于颅内静脉压高，D组和E组的两只兔子在手术后3天内死亡。 B组的吻合口通畅率为80％，C组为90％，D组为60％，E组为50％。

　　围手术期血压：术后B-E组的吻合频率无明显差异。假手术组（A组）与基线之间的术后静脉血压无明显差异。与手术后和屠宰前的基线相比，B-E组动物的静脉压力显着增加。与手术后和手术前的对照组相比，手术后静脉血压显着升高。 B和C组动物的静脉血压明显高于D和E组。 B组和C组之间以及D组和E组之间没有统计学上的显着差异。

　　脑墨水灌注：观察和比较硬脊膜微脉管系统从2毫米宽的凸状矢状窦和3毫米或更大宽度的侧窦。硬脑膜毛细血管的数量是每平方毫米微血管。对照组硬脑膜微血管的数量为12±2 mm 2、术后14天的数量略有增加至15±2 mm 2、 90天后，脑膜微血管数量显着增加，B，C，D和E组的数量分别为36±4平方毫米，39±5平方毫米，33±3平方毫米和35、为±4mm 2、 DSA测试：手术后90天，从A-E组的每组中选择4只动物进行DSA测试。动脉期的DSA图像如图4所示，静脉期如图5所示。在A组中，血管通畅，没有异常血管，并且血液循环时间为约11-15秒。在B，C，D和E组中，在耳朵和眼睛区域观察到了血管曲折，硬脑膜动静脉瘘和AVF。在一些动物中观察到不止一个动静脉瘘。在16只兔子中发现了22例动静脉瘘。 DAVF形成率为43.75％（7/16），因为其中7个具有DAVF。 DAVF主要位于SSS，海绵窦和外侧窦。 DAVF通过SSS，外侧窦和面部后静脉排泄。眼中的动静脉瘘通过前静脉引流。耳动静脉瘘通过镜后静脉引流，而颈静脉瘘通过后静脉引流。在B，C，D和E组中，循环时间延长（约32-40秒）。静脉期的循环时间明显延长，但动脉期的循环时间却没有延长（约5秒）。免疫组化法检测

　　VEGF和HIF-1α的表达水平：1周和2周组，对照组，3周和90天组枕叶皮质和血管内皮细胞中的VEGF表达远远高于那。与对照组相比，在2周的动物中SSS中VEGF的表达水平显着增加。在1周组中，与对照组和2、3、90天组相比，HIF-1α在枕叶，乳腺血管和SSS中的表达更高。 VEGF和HIF-1α表达水平的蛋白质印迹分析：枕硬脑膜中VEGF的表达类似于枕皮质和SSS区中HIF-1α的表达。 1周后，2周，3周，90天和对照组后出现表达高峰。在第1、2、3、90天，对照组枕骨中VEGF表达的平均表达水平分别为10.1、27.2、34.1、16.9和11.8。对照组的枕叶皮下1周，2周，3周和90天的HIF-1α平均表达水平分别为9.1、35.6、24.7、20.5和10.1、对照组，SSS区1周，2周，3周和90天HIF-1α的平均表达水平分别为9.4、35.6、26.7、17.7和10.6、两组之间的比较具有统计学意义。

　　结论：动物模型实验的结果表明，颅内高压是DAVF形成的关键因素。由脑缺血引起的脑灌注压力不足在此过程中起重要作用。颅内静脉压升高导致HIF-1α表达升高和VEGF表达升高。