背景简介

　　软骨细胞作为软骨组织在软骨基质中唯一存在的特定的细胞种类，在软骨组织再生与代谢方面起到了重要作用。但因软骨组织中缺少血管和神经系统，其自身修复方面存在一定的局限性。近些年，生物组织工程学将工程学和生命科学的方法原理相互结合构建人体组织或器官的功能替代物。在软骨组织工程中，体外构建的自体软骨细胞组织复合物可移植到机体受损关节修复其结构并恢复原有功能。自体软骨组织移植技术已引起人们越来越多的重视，但由于机体软骨组织中的软骨细胞相对较少，无法满足机体受损关节修复和愈合所需的软骨细胞数量;并且软骨细胞在体外扩增的过程中，会发生“去分化”现象。发生了去分化现象的软骨细胞则不宜再用于软骨组织工程。因此，本实验通过结合国内外文献，试图探讨通过简易的方法来获取大量活性化、增殖能力强的软骨细胞。

　　原代分离制备流程

　　1、新西兰大白兔耳缘静脉空气栓塞处死，乙醇浸泡2-5min，在无菌操作台中截取膝关节，打开关节腔，使用手术刀（手术剪）削（剪）取关节面软骨层；

　　2、将得到的软骨组织放入75%的乙醇中消毒放入含双抗的D-PBS中洗涤2-3次，将软骨置于含1%双抗的D-PBS中剪碎；收集含组织的悬液，自然沉降，弃上清，加入0.3% Ⅱ型胶原酶37℃，25-35min/次，4-6次，终止消化；

　　3、1000rpm，4-6min（此处不建议过高转速，过高转速会使得消化的细小碎片带入细胞，影响细胞生长），得细胞，用完全培养基重悬细胞，铺板，培养。

　　4、培养基推荐使用：DMEM/F12 + 20% FBS + 1% 谷氨酰胺 + 1% 双抗。