动物造模,药效评价 z-bio 2024-09-26 511

　　(1)模型制作  将包含HCV 5'UTR与结构基因(C1＋ E1＋E2)的片段经酶切从pHCS质粒上切下，经中间载体 pMT后再酶切，构建新的质粒(pCBE)，经扩增、纯化，调整浓度至1μg/L左右。用显微注射法将待转基因(pCBE)注入小鼠受精卵雄性前核中，注入量为1～2pl/卵，再移植至年龄为6周龄的假孕母鼠输卵管中，每侧输卵管移植20枚左右，待其发育后自然产仔。当仔鼠长至4周后，剪下长为0.5～1cm的鼠尾检测转基因鼠Hcv DNA整合情况；在无菌环境下分离提取仔鼠的肝、肾、心、脾、肠、肺、脑等脏器检测转基因小鼠HCV DNA转录水平。

　　(2)模型特点  HCV结构基因在小鼠发育早期的高表达，可导致死胎；中度表达则可导致严重多脏器组织损伤；低表达或不表达则使小鼠幸存，低表达小鼠6个月龄后80％以上可发生肝细胞脂肪变性。HCV结构基因具有明显细胞毒作用，且与表达水平密切相关。HCV结构基因高表达，可迅速导致小鼠多脏器严重损伤，使46.7％的小鼠在3～5d内死亡，从而证实HCV结构蛋白具有明显的直接致细胞病变作用。

　　(3)比较医学  自20世纪90年代有研究报道成功建立 HCV转基因小鼠模型以来，各种HCV转基因小鼠模型相继问世，从而不仅为研究HCV感染细胞的机制，病毒在肝细胞内的装配、转运及免疫病理方面提供了重要的技术保证，也为抗HCV药物的研究和筛选提供了新的方法。虽然转基因小鼠作为HCV感染模型的报道较多，但由于各种研究采用的技术方法并不完全相同，因此目前仍存在许多问题。转基因小鼠由于处于免疫耐受状态，其对HCV导致肝细胞损伤的原因，究竟是病毒的直接作用还是病毒与机体免疫系统的相互作用所致至今尚未有定论，因此尚难以将HCV转基因小鼠应用于相关疫苗的研究。