动物造模,药效评价,肝纤维化 z-bio 2024-09-02 63

　　(1)复制方法  成年大鼠，麻醉后打开腹腔，在十二指肠降部肠系膜中，寻找和游离胆总管，在其下穿2根丝线，向肝脏方向做“V”字切口，用1ml注射器向近端注入组织胶(TH胶)或N-丁基-2-氰基丙烯酸盐0.3ml/kg体重的量，行双重结扎并剪断胆总管。手术毕，常规饲养8周。期间，注意观察动物的一般活动状况和体征，动态眼眶取血制备血清作丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、结合胆红素(DBIL)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷胺酰转肽酶(GGT)、透明质酸(HA)和层连蛋白(LN)含量检测，造模结束，摘取肝脏制备匀浆作羟脯胺酸(Hyp)含量测定，并按光镜和电镜要求，分别取材作肝组织形态学检查。

　　(2)模型特点  术后1周开始，造模动物出现黄疸；2、4、8周时，血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP和GGT含量上升，血清HA和LN、肝组织Hyp含量亦随胆管阻塞时间的延长而逐渐升高。光镜下可见，造模1～3周时，肝脏小叶结构破坏，肝细胞大小不一，有些呈气球样变，汇管区有明显的炎细胞浸润，胆管扩张、淤胆、增殖、胆管上皮细胞增生，出现多量纤维细胞并向小叶内延伸形成纤维条索，多数小叶的汇管区有多量Ⅰ型及Ⅲ型胶原增生；8周时，增生的胆小管占据肝小叶大部，存留的肝细胞被增生的小胆管分割成孤岛状，沿增生的胆小管大量胶原沉积，形成较细的纤维间隔。电镜检查显示，模型组动物的大部分肝细胞，核不规则，核膜皱折或破裂，有的核仁消失，胞质内细胞器大量减少，并可见各种细胞器的崩解产物，部分粗面内质网呈囊状肿胀，其上核糖体大量脱失，有的线粒体肿胀，峭消失。细胞膜破裂不完整；肝细胞窦面绒毛脱落，细胞间连接松散、间隙增宽；毛细胆管细胞增生、腔扩大，管腔内微绒毛变形水肿，甚至缺如；毛细胆管周围及狄氏腔内可见大量胶原纤维沉积，并出现窦周毛细血管化。

　　(3)比较医学  肝外胆管梗阻可以引起梗阻部位以上胆管扩张、胆汁淤积、胆管内压力增高，并可引发肝内胆小管扩张破裂。由于肝内血管受到扩张胆管的压迫及胆汁外渗，肝细胞会发生缺血和坏死，纤维组织向胆管伸展，包围肝小叶并散布于肝细胞周围，导致纤维增生，甚至发展为胆汁性肝纤维化。采用逆行性注入组织胶(TH胶)加胆总管结扎法诱发的肝纤维化动物模型具有明显的胆汁性肝纤维化的特征。该模型主要特点：模型动物炎症反应程度较轻，肝纤维化形成速度较快，自发逆转率较低。具体表现在，造模手术后，肝细胞坏死不明显。反映肝细胞损伤程度的血清 ALT水平仅在术后1d急性大幅升高，此后快速回跌。造模1～2周时，肝组织汇管区旁胆小管增生，周围有纤维组织沉积；2周以后，胆小管周围增生的纤维组织开始包围和分隔肝小叶，同时反映肝纤维化程度的血清和组织LN和HA含量升高或维持在较高水平，4周时肝组织Hpy含量可升高至正常值的3倍。造模4～8周时，弥漫增生的胆小管周围沉积有大量的胶原，肝细胞与增生的胆小管相比明显减少，反映胆汁淤积的指标TBIL、DBIL、ALP和GGT维持在高位，血清和组织LN和HA指标仍处于较高水平。16周时，肝组织仍呈明显的纤维化，且纤维隔增粗。与单纯胆管结扎法或胆管结扎加切断法诱发的肝纤维化动物模型相比，由于后两种方法结扎的模型动物容易发生胆管再通现象，所以胆管阻塞的病因维持时间较难把握，模型动物肝纤维化特征可能在较短时间内减弱或消失。本模型之所以能够较长时间维持模型动物肝纤维化状态，在造模手术过程中向胆管内注入 TH胶或N-丁基-2-氰基丙烯酸盐是其技术关键。因为通过这种手段，在技术上保证了胆管的完全阻塞，尤其是肝内胆管的阻塞。鉴于本模型具有造模方法简单，成模周期较短，维持时间较长，病理特征明显，且可动态采用非创伤性的血清学指标，目前，已有不少学者选用本模型进行有关肝纤维化的研究。本模型比较适用于研究肝纤维化的形成机理和评价药物抗纤维化的疗效。